免疫疗法治疗实体瘤研究进展①

杨 龙 白 纯 李先亮 贺 强

(首都医科大学附属北京朝阳医院肝胆外科，北京 100020)

1 免疫细胞的抗肿瘤策略及其治疗实体瘤临床研究

细胞治疗是一种运用免疫学原理和方法，体外激活并回输患者用以杀伤肿瘤细胞的新型治疗方法。通过提高肿瘤细胞的免疫原性和对效应细胞的特异杀伤性，激发和增强机体抗肿瘤免疫应答，为治愈肿瘤提供新方向。在清除肿瘤细胞过程中，无特定靶向作用树突状细胞(DC)、细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)、自然杀伤细胞(NK)、自然杀伤T细胞(NKT)以及有特定作用靶点的各种T淋巴细胞，如嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)、肿瘤浸润性T细胞(TIL)、T细胞受体嵌合型T细胞(TCR-T)等均发挥重要作用。免疫治疗是继手术，放、化疗之后的第四大肿瘤治疗技术，受到医学界的关注，成为肿瘤治疗领域的热点和突破口。

细胞治疗可以达到两个目的，一是普遍改善肿瘤患者免疫状态，这是机体战胜肿瘤的基本保障；另一是特异或非特异地杀伤肿瘤细胞。而要达到第一个目的，一些非特异靶向免疫细胞就可以实现。目前常用非特异靶向免疫细胞亚群主要有DC、CIK、NK以及NKT等。

DC是主要的抗原提呈细胞，高水平表达MHCⅠ类和Ⅱ类分子，当表达肿瘤相关肽抗原和MHCⅠ类分子的DC细胞激活CD4和CD8 T细胞后，T细胞就会发挥效应，杀灭肿瘤细胞。DC不仅能激活T细胞，还可通过以下机制发挥抗瘤作用：①诱导产生大量效应T细胞；②趋化效应T细胞迁移至肿瘤部位；③维持效应T细胞在肿瘤部位的长期存在等。

实验研究发现，DC-CIK共培养后其抗肿瘤活性明显高于单纯DC[1]。临床研究证实，DC-CIK可诱导针对非小细胞肺癌(NSCLC)的免疫应答，改善生活质量(QOL)并延长患者的总生存时间(OS)，且没有副作用。郭伟伟等[2]通过研究发现：肝动脉化疗栓塞术(TACE)后联合DC-CIK细胞免疫治疗有助于延长患者无进展生存期，同时提高患者生存质量，但在对患者长期生存的作用上暂未有肯定结论。

DC-CIK细胞毒性诱导自体肿瘤细胞PD-L1表达上调。当体外使用靶向PD-1抗体pembrolizumab时，DC-CIK表现出有益的抗肿瘤特性并提高了IFN-γ分泌水平[3]。CIK在体内、外已经显示出对肾细胞癌(RCC)的独特抗肿瘤活性。Ag-DC-CIK治疗降低术后疾病进展和复发的风险，不能手术的患者3年总生存期(OS)和无进展生存期(PFS)显著延长。王丹红等[4]对28例晚期肾癌患者的研究中发现39%的客观响应率(ORR)和75%的疾病控制率(DCR)，没有观察到临床上显著的副作用。Erdei等[5]在38例符合标准的Ⅳ期乳腺癌患者的研究中发现：DC-CIK治疗后患者免疫功能明显增强。可见，DC-CIK对乳腺癌治疗有益。穆英等[6]对脐带血衍生的DC和细胞因子诱导的杀伤细胞(CB-DC-CIK)治疗胃癌的研究结果显示：联合治疗显著增加总体无病生存率；反映免疫功能的T细胞亚群(CD4+、CD3-CD56+和CD3+CD56+)的百分比和IFN-γ、TNF-α和IL-2的水平显著增加。在治疗中没有出现严重副作用。Gao等[7]实验后得出DC-CIK治疗降低了术后疾病进展的风险，OS增加。除放化疗外，DC-CIK免疫治疗是控制手术后胃癌和肾癌患者肿瘤生长的潜在有效方法。

NK细胞在实体瘤中的作用研究较多。射频消融(RFA)治疗可以通过增强NK细胞介导的抗肿瘤活性和NKG2D表达来有效消除肝肿瘤[8]。通过肝内动脉，西妥昔单抗和高剂量IL-2转移联合同种异体NK细胞作用于胃肠道肿瘤，耐受性良好并且有临床效应[9]。肝癌患者NK细胞G2A及其配体HLA-E在癌组织中高表达,高表达NKG2A与NK细胞功能耗竭及患者预后相关，抑制NKG2A表达可抑制肿瘤细胞的增殖[10]。Fend等[11]在NK细胞受体NCR1和NCR3以及PD-L1表达对晚期非小细胞肺癌影响的研究中发现NK细胞介导针对NSCLC的免疫监视，并且NK细胞受体可以产生有用的生物标志物，后续研究可以指导NSCLC的免疫治疗。Shiraishi等[12]通过研究发现基质金属蛋白酶(MMP)活性上调可以诱导胃癌细胞中NKG2D配体表达的下调，癌细胞对NK细胞的易感性增强，从而使得NK细胞抗肿瘤的活性增强。Sioud等[13]研究NK细胞的特性时发现：使用工程改造的肽-Fc融合物在NK细胞存在时处理癌细胞，可明显增强NK细胞的细胞毒性，使其对实体瘤具有更强的杀伤作用。

NKT在体外经α-GalCer反复刺激迅速增殖，表现出较好的细胞毒效应，同时通过介导抑制性骨髓来源细胞诱发抗肿瘤效应，诱导穿孔素/颗粒酶、FasL/Fas或TNF相关凋亡配体的表达杀伤肿瘤细胞[14]。诱导的自然杀伤T细胞(iNKT)对肿瘤细胞的监视主要通过呈递α-GalCer的iNKT间接发生，小鼠派生α-GalCer抑制肿瘤的转移，起到了抗肿瘤作用[15]。NKTs细胞毒性对神经管细胞瘤细胞高度敏感，有极强杀伤效应[16]。Rothe等[17]通过研究NK细胞激活受体NKG2D，揭示了NKG2D配体ULBP2治疗结肠癌的潜在效果。与健康对照相比，转移性结直肠癌患者中NKG2D+CD56+NKT细胞的频率显著降低,强化了NKT细胞对结直肠癌的杀伤作用，为结直肠肿瘤治疗提供新方向[18]。NKT细胞激活疗法与吉西他滨或环磷酰胺联合用于靶向肿瘤治疗并增强对肿瘤复发的预防[19]。

肿瘤患者多数存在免疫水平下降的表现，病情较重的患者淋巴细胞显著降低。特别是经过多次放化疗治疗的患者，我们观察到明显的淋巴细胞亚群频率的降低，因此通过非特异性的自体免疫细胞治疗，可以显著提高患者免疫状态，这是机体第一道防线的作用。但是如何特异地杀伤肿瘤细胞，还是很多中心研究的一个热点，靶向性的细胞治疗主要是以嵌合抗原受体修饰的T细胞(CAR-T)为载体的细胞治疗为代表。

CAR-T经过两次信号转导发挥作用。第一信号为组织相容性抗原(MHC)经提呈细胞呈递，与T细胞的受体TCR结合。第二信号为提呈细胞上的共刺激分子B7与CD28结合，在两种信号共同作用下，T细胞增殖活化成细胞毒效应T细胞(CTL)。当CTL再次遇到携带相同MHC分子抗原肽复合体肿瘤细胞时，会分泌穿孔蛋白、颗粒酶以及各种细胞因子，协同杀死肿瘤细胞[20]。 CAR-T细胞能上调干扰素IFN-γ、CD86、IL-2等的表达，进而对抗肿瘤微环境，影响肿瘤生长。最新研究发现抗GD2嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞可能是用于治疗小儿H3-K27M突变型弥漫性中线神经胶质瘤的新方法。miR-153抑制结直肠肿瘤IDO1表达并通过增强CAR T的杀伤活性而抑制异体肿瘤的生长[21]。CD56-CAR+T细胞对治疗CD56+恶性肿瘤包括神经母细胞瘤和小细胞肺癌有明显作用[22]。Bagley等[23]通过研究证实CAR-T细胞治疗胶质细胞瘤是可行和安全的。MUC1是一种高糖基化、高分子量的膜蛋白,靶向MUC1的CAR-T细胞被认为是一种可行的抗肿瘤模式。Posey等[24]近期研究表明,靶向Tn-MUC1的CAR-T细胞可在体内外杀伤白血病和胰腺癌细胞。靶向GPC3的第三代CAR-T细胞可以根除体内建立的GPC3阳性HCC异种移植物，这表明双靶向CAR-T细胞是对肝癌有希望的免疫疗法[25]。 EGFR靶向CAR-T治疗对EGFR阳性晚期复发/难治性NSCLC是安全的[26]。Li等[27]研究第三代GPC3指导的CAR-T(CARgpc3T细胞)在肿瘤模型中的抗肿瘤潜力，结果表明CARgpcT细胞可能是治疗肺腺癌(LSCC)患者新型潜在治疗剂。Song等[28]通过研究发现叶酸受体CAR-T(FRaCAR-T)可以介导已建立的三阴性乳腺癌(TNBC)叶酸受体(FRα)高水平表达时抗肿瘤活性。FRα特异性CAR-T在体外中等水平表达FRα，并对TNBC具有强有力和特异性杀伤作用。Zhou等[29]通过实验研究表明CAR-T对于乳腺癌(BC)的免疫疗法非常有效，尤其是针对转移性BC。

TIL是一种新型抗肿瘤效应细胞，在肿瘤的过继免疫治疗中具有巨大潜力。肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)和肿瘤相关巨噬细胞(TAM)也通过血管内皮生长因子(VEGF)的表达和胸苷磷酸化酶的上调促进血管生成[30]。自体TIL抗原具有特异性应答能力和多克隆性，可以潜在有效地对抗多种肿瘤靶标，达到杀灭肿瘤效果。Ⅱ期临床试验已经说明了TIL在肝脏恶性肿瘤治疗中的巨大潜力，有希望的治愈率为20%～40%。具有活化和扩展的自体TIL的免疫治疗可以成功地以低毒性进行，作为对HCC患者新型治疗方式[31]。TIL是宿主对肝内原发性和转移性肿瘤免疫应答的指示。TIL在原发IL(白介素)表达的PD-1限制了CD4+和CD8+效应T细胞的抗肿瘤免疫功能，为靶向肝肿瘤和逆转肿瘤诱导的免疫治疗提供了有力依据[32]。TIL在乳腺癌中的临床相关性已经通过其与长期阳性结果的关联而清楚的建立。PD-1/PD-L1表达，增加CD4+T细胞和B细胞浸润以及TIL密度和三级淋巴结(TLS)结构之间的重要关系[33]。有越来越多的证据表明TIL也是乳腺癌的重要免疫生物标志物，几项研究表明，肿瘤浸润淋巴细胞与乳腺癌化疗和预后改善相关联。调节性T细胞(Tregs)的群体增加，并且转录因子Foxp3的表达在肿瘤细胞和TIL上显著增加[34]，有助于对抗肿瘤，对治疗非小细胞癌有作用。

TCR-T是最近几年刚兴起的研究热点，科学界对TCR-T的研究较少。NY-ESO-1是神经母细胞瘤的抗原靶标，研究证明NY-ESO-1 TCR具有靶向表达黑素瘤和非黑素瘤的活性。NY-ESO-1tTCR-T显著延迟进展性弥散神经母细胞瘤在体内的进展[35]。继NY-ESO-1靶点的TCR-T疗法后，针对其他适应证的CEA、MAGE、MART-1靶点的TCR-T疗法陆续进入临床研究。截至2016年末，TCR-T疗法已陆续被应用于膀胱癌、肺癌等实体瘤研究中。

2 免疫细胞与其他疗法联合治疗方案及并发症

肿瘤免疫疗法包括免疫细胞治疗、免疫检查点抑制剂、细胞因子、细胞疫苗等。多种治疗方法联合应用，效果比单一使用要好。临床研究发现免疫检查点抑制剂PD-1编程抗碳酸酐酶(CAIX)靶向CAR-T对肿瘤相关抗原有高亲和力， CAR-T单链可变抗体片段(scFv)修饰的TCR是抗癌强有力的新方法。针对RANK配体的单克隆抗体denosumuab与免疫检查点抑制剂(抗CTLA-4，抗PD-1)联合治疗恶性黑色素瘤效果显著[36]。Knudson等[37]研究发现融合蛋白M7824靶向TGF-β和PD-L1/PD-1免疫抑制途径对抗肿瘤有促进作用。细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)和PD-1，对非小细胞肺癌有较好的治疗效果[38]。PD-1作用于肝细胞癌，20%的患者表现出客观反应，并且Nivolumab对先前服用索拉非尼和患者处于病毒感染状态均有效[39]。PD-1靶向单克隆抗体Nivolumab联合Ipilimumab在小细胞肺癌治疗中安全有效[40]。PD-1/PD-L1抗体对改善三阴性乳腺癌(TNBC)肿瘤微环境，提高抗肿瘤免疫力有较强作用[41]。PD-1/PD-L1靶向单克隆抗体在临床前环境中显示出抗骨髓瘤活性[42]。Riley等[43]通过对微卫星不稳定性(MSI)的结直肠癌(CRC)的深入研究，发现PD-1定向治疗是有效的并且可能在未来治疗中起中心作用。目前针对PD-1的抗体pembrolizumab和PD-L1的抗体atezolizumab均已获FDA批准用于晚期非小细胞肺癌(NSCLC)的挽救治疗[44]。科研人员在《Cell》最新发文阐明溶瘤病毒治疗可能通过改变肿瘤微环境来提高抗PD-1疗法的疗效[45]。阻断PD-1/PD-L1信号通路有助于增强CIK对胃癌和结直肠癌的细胞毒性和抗肿瘤杀伤活性[46]。PD-1、PD-L1通路的阻断可以提高CAR-T的抗肿瘤效应[47]。TIL显著增加，使得PD-1 mRNA高表达，靶向治疗乳腺肿瘤[48]。另外，免疫治疗联合手术、放化疗产生的治疗效果也比单一免疫疗法效果显著。Susana Inogés等[49]通过对胶质母细胞瘤的研究表明添加肿瘤裂解物脉冲DCs的接种肿瘤切除术和联合放化疗是可行和安全的。Zhi等[50]在单克隆抗体治疗肿瘤过程中，发现巨噬细胞可发挥巨噬细胞介导的抗体依赖的吞噬作用。并且通过体外特异性活化，增强巨噬细胞毒性，运用过继传输可实现抗肿瘤作用。综上，多种免疫疗法联合治疗实体瘤是有效的。

免疫细胞治疗肯定会有一定的副作用，目前我们观察到的DC-CIK治疗实体瘤病例，可发生失眠、厌食、关节疼痛、发热、皮疹、类感冒样症状等反应，但是这些反应，多数是一过性细胞因子释放的体现，也可以不经过任何治疗，短时间内自然缓解。个别患者出现严重的肿瘤靶器官和靶部位的攻击，更是细胞治疗有效性的体现。因为是自体免疫治疗为主，因此不会出现自身免疫疾病发生，对患者自己的肝肾功能不会有不好的影响。个别患者因为自体的免疫细胞治疗，还会带来机体年轻化的改变，白头发变黑，睡眠变好，消化功能增强，精神状态改善等，这样带给患者高质量的术后生活和治疗过程。

如果患者联合化疗，可能在联合化疗期间还可检测到恶心、呕吐、骨髓抑制和轻微器官损伤[2,6]。但是细胞治疗会减轻化疗带来的其他副作用。严重的副作用一般发生在CAR-T杀伤肿瘤细胞病例中，该治疗方法可以释放大量细胞因子进入血液循环，易引起急性呼吸窘迫综合征和多器官衰竭。此外，CAR-T还会引起脱靶效应和免疫逃逸等副作用[22]，一般在血液肿瘤治疗中多见，实体肿瘤治疗中比较少观察数据。有临床研究表明过继T细胞疗法抗肿瘤过程可产生限制性毒性[30]。部分高亲和性的TCR-T在治疗过程中也会出现脱靶效应，对正常组织造成损伤[38]。可见，免疫细胞治疗实体瘤还有很多需要注意观察的副作用，还需要更加深入的临床研究和探索。需要科学家努力将不良反应减到最低，实现最佳治疗效果。

3 展望

如前所述，多种免疫疗法在抗肿瘤方面得到应用，也有很好的疗效，并且完成Ⅰ期、Ⅱ期临床试验，临床治疗也相继开展。目前应用免疫治疗恶性肿瘤的临床病例日益增加，可以弥补手术、放化疗等传统方式“不彻底、易转移、副作用大”等不足，有些患者生存的时间能够延长3～5年，是国际公认的有希望消灭癌细胞的第四大肿瘤治疗新技术。免疫细胞联合其他多种免疫疗法共同作用产生的治疗效果明显优于单一免疫疗法。然而，免疫疗法治疗实体瘤的不良反应也不能忽略，需要临床实验和进一步研究，努力将副作用减到最低，实现最好的治疗效果。如何联合应用多种免疫疗法更好治愈实体瘤和如何最大程度减低不良反应仍是科学家们未来研究重点和探索方向。