广西人群miRNA-181a基因rs16927589位点多态性分布特点及其与血脂相关性①

雷 茗 王春芳 黄华佗 谭 昙 黄艳云 韦叶生

(右江民族医学院附属医院检验科，百色 533000)

miRNA分子是一类由内源基因编码的小RNA分子，由18～22个核苷酸序列组成，它的作用主要表现在靶基因mRNA的碱基与其3，-UTR末端互补配对，抑制或降解mRNA的表达从而起到基因调控的作用，约有1/3的基因受miRNA的调控[1-3]。miRNA-181a是miRNA-181基因家族里的重要成员，在多种疾病进展中特异性表达，作用机制同miRNA分子一样，主要是靶标mRNA与 3，-UTR末端结合，从而抑制蛋白的表达起到基因调控的作用。近期的研究发现，miRNA181a基因在心脑血管疾病的发生发展中起重要作用，其主要机制是与靶基因GRP78(热休克蛋白)、Bcl-2 mRNA结合，导致靶基因表达降低[4-6]。众所周知，血脂异常是动脉粥样硬化、心梗、脑卒中等疾病的独立诱发因素[7]，基因多态性与血脂相关性的研究也愈来愈多，Ye等[8]在对脂质代谢相关miRNA结合位点多态性与代谢综合征风险的研究中发现，FABP2基因rs5999924位点AA基因型携带者较其他基因型携带者的高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)高，在心脑血管疾病发病过程中起到保护性作用。Zhang等[9]在研究let-7基因家族rs10877887位点多态性与脑卒中发病关系中发现，rs10877887位点TT基因型携带者较TC、CC基因型携带者总胆固醇(TC)高，携带等位基因T的人群是脑卒中的易感人群。但miRNA181a基因多态性与血脂相关疾病的研究未见报道。本文探讨298例广西正常人群rs16927589位点基因多态性与HapMap公布的其他人群之间的差异，并深入研究rs16927589位点基因多态性与血脂水平的相关性，为广西人群血脂水平相关的疾病研究和群体遗传学研究奠定基础。

1 资料与方法

1.1资料 298例研究对象来源于2017年1月至2017年6月右江民族医学院附属医院健康体检者，其中女性58例、男性240例、年龄区间18～80周岁，经实验室、影像学检查，未见肿瘤、心脑血管疾病、血脂异常等，所选取研究对象之间无血缘关系，研究方案通过右江民族医学院附属医院伦理委员会审批，研究对象都签署了知情同意书。

1.2研究方法

1.2.1基因组DNA提取 空腹状态下抽取各受试对象4 ml静脉血，选取EDTA-K2抗凝，全血DNA提取试剂盒(深圳亚能公司提供)提取DNA(操作严格按照说明书进行)。

1.2.2引物设计与合成 通过NCBI查找包含rs16927589位点的适宜长度DNA片段，运用Primer 3.0软件，将查找到的DNA序列输入并进行引物设计，得到的引物序列交由上海天昊科技有限公司合成。rs16927589位点上游引物序列为5′-TAATTAGGGGCAAGGGGAGGAT-3′，下游引物序列为5′-TATGTGGGGATATGTGGGCACT-3′，延伸引物序列为5′-TTTTTTTTTTTTTTTTTTCAAAGTGAAATGTGA-TAAGAACTGTC-3′。

1.2.3PCR及测序 PCR总反应体系包括2 μl dNTPs，2 μl反应缓冲液，1 μl DNA样本，1 U TaqDNA聚合酶，上下游引物各1 μl，用高压灭菌双蒸水将体积补足至20 μl。启动PCR扩增仪相应程序进行扩增，采用2U的核酸外切酶Ⅰ(EXO Ⅰ，Epicentre)和5 U 虾碱基磷酸酶(SAP，Promega)纯化PCR产物，纯化后使用SNaPshotMultiplex Kit(ABI)进行延伸反应，延伸完毕，加入1 U SAP 酶纯化产物，采用ABI3730XL测序仪测序，将样本DNA用DNA测序法再次进行测序检测，以保证实验结果的准确性，用Gene-Mapper 4.1(Applied Biosystems Co．Ltd．，USA)分析最终的原始测序数据。

1.2.4血脂检查 空腹12 h，次日早晨静息状态下静脉采血4 ml，离心分离血清，在日立7600生化仪上分别用相应试剂检测血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和极低密度脂蛋白胆固醇(VLDL-C)。

2 结果

2.1miRNA-181a 基因rs16927589位点基因型和等位基因 rs16927589位点基因型分布符合哈迪-温伯格定律(Hardy-Weinberg)，说明所选取受试对象具有群体代表性。测序结果显示，rs16927589位点包含3种基因型，分别为TT、CT和CC，见图1，其所占频率分别为73.49%、25.50%和1.01%，等位基因T和C的频率为86.24%和13.76%。

2.2广西人群miRNA-181a基因rs16927589位点多态性在性别间的比较 经检验，miRNA-181a基因rs16927589位点基因型及基因频率分布在广西人群不同性别间比较，差异没有统计学意义(P>0.05)，见表1。

2.3广西人群miRNA-181a基因rs16927589位点多态性与其他种族(地区)人群之间比较 广西人群rs16927589位点基因型与HapMap-YRI、HapMap-CEU比较，差异有统计学意义(P<0.001)，与Hap-Map-GIH、HapMap-JPT比较，差异有统计学意义(P<0.05)，与HapMap-HGB比较，差异没有统计学意义(P>0.05)，见表2。

图1 miRNA-181a基因rs16927589位点测序图Fig.1 Sequencing map of miRNA-181a gene rs16927589 site

2.4广西人群miRNA-181a基因rs16927589位点三种基因型携带者之间血脂水平比较 经统计学检验，rs16927589位点TT、CT和CC三种基因型携带者之间高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)和极低密度脂蛋白(VLDL-C)比较，差异没有统计学意义(P>0.05)；CC组与TT、CT组胆固醇(TC)比较，差异有统计学意义(P<0.05)，CC组的胆固醇(TC)水平较TT、CT组低，TT组与CT组比较，差异没有统计学意义(P>0.05)；在三酰甘油(TG)比较中，TT组与CT组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，TT组的三酰甘油(TG)较CT组低，CC组与TT、CT组分别比较，差异没有统计学意义(P>0.05)，见表3。

表1 广西人群miRNA-181a基因rs16927589位点基因型、等位基因频率在不同性别间的比较Tab.1 Comparison of genotype and allele frequency of miRNA-181a gene rs16927589 locus in Guangxi population by sex

表2 广西人群miRNA-181a基因rs16927589位点基因型与其他种族(地区)人群之间的比较Tab.2 Comparison of genotype of miRNA-181a gene rs16927589 site in Guangxi people with other ethnic populations

表3 广西人群miRNA-181a基因rs16927589位点三种基因型之间血脂水平比较Tab.3 Comparison of lipid indexes among genotypes of rs16927589 in miRNA-181a

3 讨论

近年来，miRNA-181基因家族在多种疾病中的差异性表达陆续被报道，成为生物医学界关注的热点。miRNA-181a 基因是miRNA-181基因家族里的重要成员，研究发现，miRNA-181a 基因通过靶向调控炎症因子参与了系统性红斑狼疮(SLE)的发病过程[10]，而且在脑卒中的发展过程中也异常表达[11]，在恶性肿瘤的发生、侵袭、凋亡、转移以及耐药机制中发挥重要的调节作用[12,13]。然而，由于地理位置、生活环境、风俗习惯等的差异，基因多态性也会表现出差异性，既往研究发现，基因多态性的差异性往往与疾病的易感性密切相关。例如，相关研究对罗马人和匈牙利人听力障碍相关NAT2、GRM7、GRHL2易感性基因多态性的研究中发现，NAT2、GRM7、GRHL2基因多态性表现出很显著的种族间差异，这种种族间基因多态性的差异与听力障碍相关疾病的易感性相关，所以研究不同种族正常人群基因多态性的差异能为与之相关的疾病研究奠定理论基础。

本研究发现，广西人群miRNA-181a 基因rs16927589位点单核苷酸多态性在不同性别之间比较，差异没有统计学意义，提示在同一种族不同性别间，基因多态性不存在差异；将广西人群进一步与HapMap-YRI、HapMap-CEU、HapMap-GIH和HapMap-JPT比较，差异均有统计学意义，其主要原因可能为广西人群与HapMap-YRI、HapMap-CEU、HapMap-GIH和HapMap-JPT均不是同一种族，其遗传背景、生活环境、风俗习性、饮食习惯等均不相同[14-16]，而导致其基因多态性的差异。而将广西人与HapMap-HGB之间比较发现，差异没有统计学意义，其原因可能为广西人与HapMap-HGB同属于一个种族，亲缘关系近。这也验证了Matyas 等[17]提出的不同种族间基因多态性存在差异的观点。

大量研究表明，血脂异常与心脑血管疾病的发生发展有着密切的联系[18-20]，血脂受到多基因位点的调控，这些基因在调控血脂过程中，由于种族，地理位置不同，基因发挥的作用大相径庭，而同一位点突变的基因型与血脂的关系在不同种族人群间也存在差异[21]，因此，了解特定地区人群的血脂水平，探讨与血脂水平相关的基因多态性，并对血脂水平加以控制，对该地区与血脂异常相关疾病的防治工作有重要意义。本研究发现，rs16927589位点CC基因型的胆固醇(TC)水平较TT、CT低， CT基因型的三酰甘油(TG)水平较TT基因型高，提示广西人群中rs16927589位点单核苷酸多态性与血清胆固醇(TC)水平和三酰甘油(TG)水平有关，在miRNA-181a 基因与血脂相关疾病的研究中，rs16927589位点具有研究价值。

综上所述，本次研究不仅为进一步疾病研究奠定了基础，也为人类群体遗传学以及基因多态性的研究提供了数据。然而，本次研究也存在一定缺陷。一方面，本次纳入的研究人群男性多于女性，可能会对基因型与血脂水平的相关性分析产生一定影响。另一方面，本次研究存在一些不能测量的因素，如遗传因素、饮食规律、环境因素等对血脂产生的影响，而且样本量较少，可能存在一定的抽样误差，为了进一步验证这种相关性，应加大样本量研究 。