类风湿关节炎患者破骨细胞分化情况及其与骨破坏的关系①

蔡 辉 徐子涵 商 玮 郭郡浩 赵智明 沈俊逸

(东部战区总医院(原南京军区南京总医院)中西医结合科，南京 210002)

类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是最常见的炎性关节病，可导致进行性关节损伤和关节功能丧失，进而造成残疾[1]。已有研究表明，骨质流失在RA疾病早期就开始了，RA合并骨质疏松症的发生率较一般人群明显增加[2]。破骨细胞(Osteoclast，OC)是人体内的主要骨吸收细胞，RA骨破坏主要是由于OC异常活化导致的[3]。本研究通过分离RA患者外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，经核因子κB受体活化因子配体(Receptor activator of nuclear factor-κB lig-and，RANKL)和巨噬细胞集落刺激因子(Macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)诱导培养为OC，观察RA患者OC的分化情况，并分析该分化情况与RA骨破坏的关系，探究OC在RA骨破坏中的作用，以期为RA骨破坏的防治提供依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1对象 选取2013年至2014年在东部战区总医院中西医结合科就诊的符合2010年RA分类标准[4]的活动期RA患者12例，其中男2例，女10例，年龄(42.3±14.4)岁。健康志愿者10例为对照组，男7例，女3例，年龄(42.2±18.5)岁。两组入选者均无长期服用抗凝剂、性激素及影响骨代谢的药物史，无糖尿病、甲状腺、甲状旁腺等内分泌系统疾病，无严重肝肾功能损害。两组患者均签署知情同意书，并经过东部战区总医院伦理委员会批准。

1.1.2试剂 RANKL、M-CSF(Pepro Tech公司，美国)、α-MEM培养基(Gibco公司，美国)、胎牛血清(FBS)(杭州四季青，中国)、人淋巴细胞分离液(Sigma公司，美国)、抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)染色试剂盒(南京建成，中国)、甲苯胺蓝染液(上海碧云天，中国)。

1.2方法

1.2.1建立外周血OC培养体系 分别采集RA组和对照组外周血8 ml，采用Ficoll密度梯度离心法分离获得PBMC，用α-MEM完全培养液配制成PBMC细胞悬液，调整细胞密度为2×106个/cm2接种于培养皿。培养箱(37℃、5%CO2)中孵育2 h，弃培养液，贴壁细胞为单核细胞，胰酶消化，调整细胞密度为2×105个/cm2接种于空白24孔板和已预置骨磨片的24孔培养板中，设3个复孔，用α-MEM完全培养液(含100 μg/L RANKL、50 μg/L M-CSF)培养，置于37℃、5%CO2培养箱中，2～3 d换液1次。

1.2.2TRAP染色并计数 培养14 d后对接种于空白24孔板中的细胞进行TRAP染色。按TRAP染液说明书(南京建成)配制30 ml底物孵育液，37℃水浴10 min；用固定液将细胞固定5 min，水洗，加入底物孵育液37℃避光孵育60 min，水洗，用甲基绿复染 2～3 min，水洗。光镜下观察，胞浆呈深红色为阳性反应。将TRAP染色阳性且细胞核≥3个的多核巨细胞认定为OC。每孔随机取10个视野计数OC个数，重复计数3次，取均值。

1.2.3骨吸收功能检测 培养21 d后取出骨磨片，将其分为A、B两组，2.5%戊二醛将A组骨磨片固定10 min，乙醇脱水，加入1%甲苯胺蓝染色10 min，水洗，光镜下观察骨吸收陷窝；B组骨磨片经2.5 %戊二醛固定2 h，1%锇酸固定2 h，乙醇逐级脱水，临界点干燥，镀金膜，扫描电镜下观察骨吸收陷窝。

1.2.4RA患者骨破坏的临床评估 双手X线Sharp评分：对RA患者进行双手X线摄片，由专业的放射科人员阅片，参照改良的Sharp评分标准[5]，对手和腕18个区域进行关节间隙狭窄评分(0～4分)，对17个区域进行骨侵蚀评分(0～5分)，计算关节间隙狭窄评分与骨侵蚀评分之和。

1.2.5骨密度(Bone mineral density，BMD)检测 采用美国GE公司的Lunar Prodigy骨密度仪通过双能X线吸收法(Dual energy X-ray absorptiometry，DXA)对RA患者腰椎L1-L4、全髋部、股骨颈进行检测，以T-score(T值)最低处表示BMD。

2 结果

2.1两组OC生成数量的比较 经TRAP染色后，显微镜下观察，两组均可见TRAP阳性细胞的多核巨细胞，细胞体积大，呈类圆形，胞浆着色加深，细胞内可见3～5个以上细胞核(见图1)。RA组生成的OC数量较对照组明显增加，差异有统计学意义(P< 0.05)，见图2，表1。

2.2两组骨吸收陷窝实验的比较 细胞与骨磨片共培养21 d，光镜下可见A组骨磨片上出现深染的骨吸收陷窝，边界清晰，呈类圆形或不规则形。与对照组对比可见，RA组形成的骨吸收陷窝数量较多，面积较大(见图3)。扫描电镜观察B组骨磨片，可见陷窝底部具有因骨胶原纤维残留而显粗糙的骨吸收特征，陷窝边缘呈贝壳状或不规则形。RA组形成的骨吸收陷窝面积较大，陷窝较深，呈穿凿样；而对照组形成的骨吸收陷窝面积小而浅(见图4)。

图1 光镜下TRAP染色的观察Fig.1 Observation of TRAP staining under an optical microscopeNote: A.×100；B.×200；C.×400.

图2 两组TRAP染色比较(×200)Fig.2 Comparison of TRAP staining in two groups(×200)Note: A.RA Group；B.Control Group.

表1 两组OC生成数量比较(个/10个视野)Tab.1 Comparison of OCs numbers in two groups (/10 bins)

图3 光镜下骨吸收陷窝的观察(×200)Fig.3 Observation of bone resorption lacunae under an optical microscope(×200)

2.3相关分析 对RA组患者进行骨质破坏的临床评估(Sharp评分和BMD检测)，将RA组OC数量分别与Sharp评分和BMD(T值)进行相关分析。RA组OC数量与Sharp评分呈显著正相关(r=0.810，P=0.001)，与BMD(T值)呈显著负相关(r=-0.685，P=0.014)(见表2，图5)。

图4 扫描电镜下骨吸收陷窝的观察(×1 000)Fig.4 Observation of bone resorption lacunae under a scanning electron microscopy(×1 000)

表2 RA组OC数量与骨质破坏临床指标的相关分析(n=12)Tab.2 Analysis of number of OCs and clinical indicators of bone destruction in RA group(n=12)

图5 RA组OC数量与Sharp评分和BMD相关性分析散点图Fig.5 A scatter diagram of correlation analysis between number of OCs and clinical indicators of bone destruction

3 讨论

RA好发于40～50岁女性，在我国RA的临床患病率为0.32%～0.38%[6]。RA会造成关节软骨破坏和骨侵蚀，影响关节功能而降低患者生活质量。高疾病活动度、自身抗体阳性和早期关节损伤，往往是不良预后的特征性因素[7]。

OC是主要的骨吸收细胞，来源于单核/巨噬细胞系统。OC的异常增生与活化在RA骨破坏中发挥重要作用[8]。在胶原诱导性关节炎小鼠模型的研究中发现，滑膜组织及邻近区域富集着大量RANK表达阳性的破骨样细胞(Osteoclast-like cell，OLC)，与局部骨侵蚀密切相关[9]。那么，与一般人群相比，RA患者体内OC的分化情况是否有所不同呢？本研究将RA患者外周血单核细胞作为研究对象，通过外周血单核细胞诱导培养法建立OC培养体系，通过TRAP染色及骨吸收陷窝实验对OC进行鉴定，结果显示该方法能诱导培养出功能成熟的OC。观察RA患者外周血OC的分化情况，与正常人群进行对比发现，两组外周血单核细胞诱导生成的OC形态相似，RA患者外周血OC生成的数量明显增加，骨吸收功能明显增强，这与Durand等[10]的研究结果相一致，提示RA患者外周血OPC向OC的分化能力增强。在RA患者中，一方面炎性细胞因子直接或间接诱导OC分化并促进其功能[11]；另一方面RA相关自体抗体不仅引起自身免疫复合物的形成而导致滑膜炎的发生，而且能与OPC结合直接促进骨丢失[12]。

国内外相关研究多采用影像学分级对RA患者的手、腕关节局部骨质破坏进行评估，其中Van等[5]修订的Sharp评分最为常用。BMD的测定可一定程度上反映RA患者全身骨丢失的情况。为进一步探究RA患者OC分化能力增强与RA骨破坏的关系，本研究通过Sharp评分和BMD检测评估RA患者骨破坏的情况，并与这些患者外周血诱导生成的OC数量进行相关性分析，结果显示RA外周血生成的OC数量与Sharp评分呈显著正相关，与BMD(T值)呈显著负相关，提示RA外周血生成OC的数量及功能与RA关节骨破坏和骨丢失的严重程度密切相关。本研究尚存在不足之处，因实验时间及经费的局限性，采集的RA患者及健康志愿者的样本量较少，后期应当进一步完善。

综上所述，RA患者外周血OPC向OC的分化能力增强，且与RA关节骨破坏和骨丢失的严重程度密切相关，然而其内在机制尚未完全阐明，关于RA骨破坏机制的研究还需更深入的探索。