IL-31通过调控TGF-β1/Smad4信号通路促进骨质疏松的机制研究

郝 喆 杨文静 倪 娟

(武汉市第四医院风湿免疫科，武汉 430033)

骨质疏松是骨代谢障碍的一种全身性骨骼疾病，其特征在于骨组织的微小结构退化和骨量的减少[1]。过度的骨吸收和/或不充分的骨形成易出现骨脆性增加和骨折发生[2]。破骨细胞和成骨细胞的动态改变在骨质平衡和骨质疏松的过程中发挥着重要的作用[3]。机体免疫细胞分泌的细胞因子可通过促进破骨细胞生成和抑制成骨细胞分化而促进骨质丢失[4]。IL-31属于gp130/IL-6细胞因子家族，其受体在各器官组织中分布广泛，免疫细胞和非免疫细胞中均存在IL-31受体，IL-31参与免疫调节、炎症反应、髓系造血等多种生理及病理过程[5]，但IL-31在骨质疏松中的作用尚不清楚。因此本研究主要探讨IL-31在骨质疏松患者血清中的表达情况，并通过骨质疏松小鼠模型及细胞学实验探讨IL-31调控骨质疏松的分子机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1病例资料 共纳入2015年1月～2016年12月我院收治的100例骨质疏松症患者为研究对象(研究组)，其中男性29例、女性71例，年龄51～84岁，平均(66.4±13.3)岁。另按年龄、性别配对选取100例同期在本院健康体检中心体检的健康人群(对照组)，其中男性29例、女性71例，年龄51～84岁，平均(65.1±12.9)岁。

1.1.2纳入及排除标准 研究组患者均符合骨质疏松诊断标准：即：①临床表现：出现周身疼痛、身高降低、驼背、脆性骨折和呼吸系统受损等；②骨密度检查：骨密度在年轻成人平均值2.5 SD以下(T值<-2.5 SD)。排除标准：①长期营养不良或低钙饮食；②伴有系统性疾病；③恶性肿瘤；④影响骨代谢药物服用史；⑤代谢性疾病；⑥长期卧床。

1.1.3试剂与仪器 主要试剂包括高糖DMEM培养基、胎牛血清(Gibco，美国)，链霉素、青霉素鼠二抗和兔二抗、CCK8检测试剂盒(碧云天，上海)，人IL-31 ELISA试剂盒转染试剂Lipofectamine 2000(Thermo Fisher，美国)，ALP检测试剂盒(Beckman，美国)，IL-31、TGF-β1、Smad4、p-Smad4和Actin抗体(Cell Signaling technology，美国)，Annexin V/PI凋亡检测试剂盒(BD，美国)。鼠源IL-31 qPCR引物(正向5′-TCCTGATGTTCCCAA-CCCTG-3′、反向5′-TTAGGACCACGTCTTCTGTGT-3′)由上海生工生物合成。IL-31 shRNA (shIL-31)及对照shRNA(shCon)购自上海吉凯基因。C57BL/6J野生型小鼠、C57BL/6J背景的IL-31基因敲除小鼠购自武汉大学实验动物中心，小鼠成骨细胞MC3T3-E1购自武汉大学典型培养物保藏中心。主要设备包括细胞培养箱、生物安全柜、Biotek酶标仪、流式细胞仪、Bio-Rad垂直电泳仪、Bio-Rad Western blot化学发光成像系统、Roche LightCycler 480实时荧光定量PCR仪。

1.2方法

1.2.1人外周血IL-31浓度测定 收集研究组和健康对照组志愿者的空腹血，离心分离上清，严格按照IL-31 ELISA试剂盒说明书进行操作、定量。

1.2.2骨质疏松小鼠模型构建 取健康的C57BL/6J野生型和IL-31敲除小鼠各30只，均为雌性、4～5周龄，随机分为2组，即卵巢切除术组(OVX)15只、假手术组(Sham)15只，分别进行手术操作。术后8周通过眼球取血获得并分离小鼠血清，测定血清钙离子、磷、ALP浓度；取OVX及Sham组小鼠的双侧股骨进行病理切片分析股骨组织形态学结构，分离脊柱并通过骨密度仪检测脊柱骨密度值。

1.2.3BMSCs的体外培养与检测 采用全骨髓法培养BMSCs细胞。细胞分离后置于37℃、5%CO2的培养箱中培养，每3 d换液1次，待细胞密度达到80%～90%时，用0.25%的胰酶进行消化传代。当细胞传至第3代时，取各组BMSCs，计数细胞并调整浓度至1×105个/ml，接种于96孔板中，每孔100 μl细胞悬液、设置6个复孔。接种后每48 h换液一次，并于第2、4、6天以CCK8法检测各组细胞在450 nm波长处的吸光度值，判断细胞增殖活力。在细胞培养第4天，移除培养基，裂解细胞后通过全自动生化分析仪测定每孔细胞的ALP浓度。另取第3代BMSCs细胞，提取总蛋白并进行蛋白定量，Western blot法检测TGF-β1、Smad4和p-Smad4的表达，并以Actin为内参。

1.2.4MC3T3-E1细胞转染及检测 采用脂质体Lipofectamine 2000转染法将shIL-31和shCon转染至MC3T3-E1细胞，转染48 h后，计数细胞并接种于96孔板中，每隔48 h通过CCK8法测定细胞增殖；另通过流式细胞仪检测细胞凋亡，提取细胞总RNA和总蛋白，检测IL-31的敲除效率和相应蛋白表达水平。

1.3统计学分析 本研究所有实验组均重复3次，所有数据采用SPSS22.0软件分析，计量资料以独立样本t检验进行两两比较，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1骨质疏松患者与健康人血清IL-31浓度比较 骨质疏松患者的血清IL-31平均浓度(43.12±4.97)pg/ml显著高于健康对照组人群的血清IL-31平均浓度(19.58±2.09)pg/ml，差异具有统计学意义(P<0.05，图1A)。进一步将骨质疏松患者分为轻度骨质疏松(37例，T值<-2.5 SD)和重度骨质疏松(63例， T值<-2.5 SD且有一次以上的骨质疏松性骨折)后发现，重度骨质疏松患者的血清IL-31平均浓度(51.52±6.90)pg/ml显著高于轻度骨质疏松患者的血清IL-31平均浓度(33.75±6.16)pg/ml，差异具有统计学意义(P<0.05，图1B)。

2.2骨质疏松小鼠模型的建立 通过Sham和OVX手术建立骨质疏松及对照模型小鼠。术后8周血清学指标检测显示，野生型小鼠、IL-31敲除小鼠的OVX手术组的血钙离子和血磷均高于Sham手术组、但ALP水平显著低于Sham手术组(均P<0.05，见表1)。接受OVX手术的IL-31敲除小鼠血钙离子和血磷浓度均明显低于接受OVX手术的野生型小鼠、而ALP高于野生型小鼠(均P<0.05，见表1)。

图1 骨质疏松患者与健康人血清IL-31浓度比较Fig.1 Comparison of serum IL-31 between osteoporosis patients and healthy control groupNote: **.P<0.01,***.P<0.001.

术后8周小鼠股骨组织(图2A)病理切片及脊柱骨密度结果(图2B)显示，接受OVX手术的野生型小鼠和IL-31敲除小鼠均出现骨组织形态结构破坏和骨密度降低，但IL-31敲除小鼠的骨组织形态学结构破坏程度和骨密度降低程度均较野生型小鼠轻(P<0.05)。

2.3BMSCs增殖及相关蛋白水平检测 细胞增殖检测结果显示接受OVX手术的IL-31敲除小鼠组BMSCs的体外增殖能力显著高于Sham手术的IL-31敲除小鼠组和接受OVX手术的野生型小鼠组(P<0.05，图3A);ALP检测结果显示IL-31能够抑制ALP的合成(P<0.05，图3B)。Western blot结果显示接受OVX手术的IL-31敲除小鼠BMSCs细胞的TGF-β1、Smad4磷酸化水平均显著高于接受OVX手术的野生型小鼠组(图3C)。

2.4IL-31对小鼠成骨细胞MC3T3-E1凋亡影响 MC3T3-E1细胞转染IL-31 shRNA后，IL-31的mRNA水平显著降低(图4A)，MC3T3-E1细胞增殖加快(图4B)、凋亡减少(图4C)，TGF-β1和Smad4磷酸化水平升高(图4D)。

表1 术后8周小鼠血清学指标(n=15)Tab.1 Serum biomarker in mouse model in 8 weeks post-surgery(n=15)

图2 小鼠股骨病理切片及脊柱骨密度比较Fig.2 Comparison of pathological sections of femur and spinal bone density

图3 BMSCs的增殖、ALP合成、TGF-β1表达和Smad4激活检测比较Fig.3 Comparison of BMSCs proliferation,ALP synthesis,TGF-β1 expression and Smad4 activation of BMSCs

图4 IL-31对小鼠成骨细胞MC3T3-F1增殖和凋亡的影响Fig.4 Influence of IL-31 on proliferation and apoptosis of mice osteoblast MC3T3-E1

3 讨论

近年来研究认为，机体免疫系统能够通过生理和病理过程调节骨骼重塑而介导骨质疏松的发生，从而提出了骨质疏松是一种慢性免疫性疾病的概念[6]。尽管骨密度降低与多种病理状态有关，但衰老和雌激素缺乏被普遍认为是骨质疏松发生的两个重要危险因素[7]。但也有研究报道了血清中的部分细胞因子与骨质疏松症的发生发展密切相关，如绝经后骨质疏松患者可发现血清IFN-γ、IL-6和IL-17等细胞因子的升高[8]。而在本研究中，我们发现骨质疏松患者的血清IL-31水平显著高于健康人群，并且随着骨质疏松严重程度的增加，血清IL-31水平也明显增加，提示IL-31水平的升高可能促进骨质疏松的发生和恶化。另外，通过骨质疏松小鼠模型的建立，我们发现IL-31敲除小鼠骨质疏松严重程度显著低于野生型小鼠，提示抑制IL-31的生成和分泌能够减缓骨质疏松的进展。

多种细胞因子和转录因子参与骨质疏松的发生进展，其中一些因子受IL-31的调节。如IL-31与细胞膜上的受体形成受体配体复合物后能够激活受体酪氨酸激酶，从而激活细胞内的信号转导，包括STAT3、Akt、NF-κB、MAPK和PI3K等细胞内信号转导通路[9]，而这些信号通路已被证实参与骨骼重塑和炎症发生、介导破骨细胞增殖和活化、促进成骨细胞衰老和凋亡[10]。也有研究表明，IL-31能够通过免疫细胞分泌促炎因子(如IL-1β、IL-6)、趋化因子(如CXCL1、CXCL8、CCL2和CCL18等)和基质金属蛋白酶等，从而作用于破骨细胞而促进其分化、趋化，并增强破骨细胞的功能而介导骨骼重塑发生，提示IL-31在促进破骨细胞前体细胞的分化过程起到重要的作用[11]。

TGF-β1是细胞和组织中含量最丰富的TGF-β超家族成员。在骨代谢过程中，TGF-β能够介导骨形成和骨吸收之间的偶联，增强成骨细胞的数量和活性，并刺激其增殖和分化，调节骨重建，维持骨代谢平衡[12]。另外，TGF-β1还能够促进破骨细胞凋亡、抑制破骨细胞的增殖。骨质疏松患者骨小梁内TGF-β 含量下降，如果给予外源性TGF-β补充，可使骨形成增加、破骨细胞的破骨作用减弱[13]。而Smad蛋白家族是TGF-β细胞内信号转导因子，能够通过与细胞核内其他转录因子结合或直接调控DNA转录而介导TGF-β的信号转导。Smad4是TGF-β1各类信号转导通路中的共同介质，磷酸化的Smad4是其活性形式，介导TGF-β1的信号传递[14]。在本研究中，通过原代BSMCs细胞和小鼠MC3T3-E1成骨细胞的体外研究发现，抑制IL-31后能够增强细胞内TGF-β1的表达，并增强TGF-β1下游的Smad4的磷酸化从而促进BSMCs细胞和MC3T3-E1成骨细胞增殖，并抑制凋亡发生，提示IL-31能够通过反向调控成骨细胞内的TGF-β1/Smad4通路来抑制成骨细胞的增殖和活性。

综上所述，本研究发现骨质疏松患者体内IL-31水平明显升高，并且升高程度与骨质疏松的严重程度相关。通过骨质疏松小鼠模型和细胞学研究证实，IL-31的下调能够活化TGF-β1/Smad4信号通路而增强成骨细胞增殖活力而抑制骨质疏松发生。因此抑制患者IL-31水平可能是预防骨质疏松形成或程度加重的潜在治疗靶点。