衰老细胞清除剂研究进展

苏路路，管博文，樊飞跃，李德冠，孟爱民

(1. 中国医学科学院, 北京协和医学院医学实验动物研究所比较医学中心，国家卫生健康委员会人类疾病比较医学重点实验室, 新发再发传染病动物模型研究北京市重点实验室，北京市人类重大疾病实验动物模型工程技术研究中心, 北京 100021；2. 中国医学科学院放射医学研究所，北京协和医学院，天津市放射医学与分子核医学重点实验室，天津 300192)

1961年，Hayflick等[1]发现，原代细胞体外培养50代以后就丧失了分裂能力，但细胞是存活的，首次提出了细胞衰老也就是复制性衰老的概念，由此开创了细胞衰老研究领域。随着细胞衰老发生机制的深入研究，体内外细胞衰老模型的建立、细胞衰老生物学标志的发现，近年来，在阐明细胞衰老的生物学过程，探讨细胞衰老在器官组织功能减退、老年病发生过程中的作用等方面的研究取得了许多重要进展[2]。衰老细胞已经成为防治老年病的一个新靶点，清除衰老细胞的药物也逐渐成为研发热点。本文将老年病发生、发展过程中衰老细胞的作用，以及清除衰老细胞的药物——衰老细胞清除剂(senolytics)的相关研究进行综述。

1 细胞衰老及衰老细胞特点

1.1 细胞衰老概念早期细胞衰老的概念局限于体外培养细胞停止增殖，即复制性衰老。目前，细胞衰老的概念应用非常广泛，如机体与年龄相关的组织再生能力下降、肿瘤抑制、炎症、伤口愈合及胚胎发育过程中出现的细胞周期阻滞。Sharpless等[3]撰文建议将细胞衰老定义为应激引起细胞停止增殖，在丝裂原和癌基因刺激下不能再次进入细胞周期。

1.2 衰老细胞特征细胞衰老时，细胞的功能发生了特征性改变。衰老细胞的特征是细胞永久性生长阻滞、凋亡抵抗和衰老相关分泌表表型(senescence-associated secretory phenotype，SASP)的产生。

衰老细胞的特征之一就是永久性生长阻滞。诱导细胞衰老的因素研究最多的是DNA损伤、端粒缩短及癌基因激活，其他因素如PTEN缺陷、丝裂原应激和非折叠蛋白反应，都可以诱导细胞衰老。p53-p21-RB及p16INK4A-RB通路均参与细胞生长阻滞。DNA损伤及端粒黏性末端暴露通过激活DNA损伤应答通路，进而激活p53，提高下游细胞周期抑制因子p21的表达水平，启动细胞周期阻滞；而p38-MAPK通路通过上调BMI1、ETS1和ETS2的表达，进而转录激活p16INK4A，介导细胞周期永久性阻滞。生长阻滞是机体抑制肿瘤发生，延长患者生存的重要保护机制之一，如果损伤强度过大，持续时间过长，尤其是组织干细胞出现衰老，就会导致组织的再生和更新能力下降[4]。

衰老细胞具有抗凋亡作用。细胞受到应激刺激后会启动一系列应激信号通路，阻滞细胞周期，并进行损伤修复。由于应激刺激的性质、强度、细胞类型和细胞增殖状态的不同，细胞可能出现完全修复，继续进入细胞周期；细胞不能完全修复，继续增殖可能会发生细胞转化；细胞不能修复，继续进入细胞周期可能会出现细胞凋亡或衰老。研究显示，细胞内p53依赖的信号通路激活水平的高低，对损伤细胞发生凋亡还是衰老，起着重要的决定性作用。细胞应激时，如果p53的水平较低，激活下游凋亡通路效应蛋白的能力较弱，细胞会出现衰老而不是凋亡；细胞中对抗凋亡的Bcl-2家族蛋白包括Bcl-2、Bcl-XL和Bcl-W的表达水平升高，也是细胞出现衰老的原因之一；p53的翻译后修饰也会影响到细胞是发生衰老还是凋亡，如果K117乙酰化位点缺失，细胞会丧失凋亡的能力，但仍可以通过p53-p21通路诱导细胞衰老[5]。

衰老细胞能分泌各种细胞因子，包括炎性因子、蛋白溶解因子和生长因子等，称为SASP。SASP组成非常复杂，会随着细胞类型、诱导的刺激类型和诱导时间的不同发生变化。早期的SASP主要是通过p38 MAPK和NF-κB上调TGF-β表达，导致周边细胞发生周期阻滞，进而出现细胞衰老；继而Notch活性增强，SASP成分转换为IL-1α、IL-6及IL-8。但是体内SASP分泌的规律有待进一步阐明。在伤口的愈合过程中，衰老细胞分泌的SASP可以招募免疫炎症细胞的聚集，继而促进组织修复和清除衰老细胞，对机体起到有益的作用。如果免疫细胞清除能力下降，衰老细胞出现堆积，增多的SASP形成炎性微环境，可造成组织干细胞功能损伤，这可能与多种慢性炎症及老年退行性病变有关，甚至能够促进肿瘤的生长和转移[2]。

1.3 衰老细胞检测指标1961年，Hayflick等[1]发现原代细胞体外培养可以出现复制性衰老，并且发现老年来源的原代细胞复制能力更低，提示细胞衰老可能是老龄化器官组织丧失修复能力的驱动因素，但在体内无法得到证实。1995年，组织及体外培养的细胞中发现衰老相关β-半乳糖苷酶(senescence-associated beta-galactosidase，SA-β-Gal)阳性细胞是衰老细胞所特有，之后SA-β-Gal染色作为检测衰老细胞的生物学标志之一。临床上对冠心病患者动脉粥样硬化的样本进行SA-β-Gal染色，发现动脉粥样硬化病变中血管内皮细胞出现衰老表型，并且与端粒缩短有关，提供了细胞衰老与心血管病变相关的体内证据[6]。

周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinases，CDK)抑制因子p16INK4A是衰老细胞周期抑制的主要调节因子，在老年实验动物组织的衰老细胞中特异性表达；BubR1表达水平下降的早衰模型，小鼠的脂肪及肌肉组织中p16INK4A表达均升高；去除p16INK4A表达可以减少脂肪及肌肉组织的衰老细胞数目，并改善小鼠的早衰表型[6]。

上述两个指标作为衰老的生物学标志，在探究衰老细胞的功能中发挥了至关重要的作用。

2 细胞衰老与老年病

衰老细胞可以降低细胞复制及组织修复能力，分泌细胞因子招募炎性细胞，参与细胞外基质重塑及组织纤维化，诱导细胞死亡，并能够抑制干细胞功能。近年来研究发现，衰老细胞堆积与老龄化过程中发生的退行性病变有关[3]。

有丝分裂检查点BUBR1蛋白由Bub1b基因编码，Bub1b缺陷的小鼠可出现早衰表型。研究发现，Bub1b缺陷的早衰小鼠骨骼肌、眼和脂肪组织中堆积了大量的p16INK4A阳性衰老细胞。衰老细胞堆积可以导致小鼠出现自然老龄化的特征，包括肌少症、白内障和脂肪代谢紊乱。Burd等[7]利用p16INK4A转基因小鼠模型，发现随着年龄增长，小鼠体内表达p16INK4A阳性的细胞逐渐增多。表明了衰老细胞堆积与老龄化改变有关。

两种清除衰老细胞转基因小鼠系统的建立，即INK-ATTAC(INK-linked apoptosis through targeted activation of caspase，INK-ATTAC)小鼠及p16-3MR(p16-trimodality reporter，p16-3MR)转基因小鼠，为衰老细胞在老龄化组织功能衰退中的驱动作用提供了关键性证据。INK-ATTAC小鼠的p16INK4A阳性细胞中表达FK506结合蛋白(FK506 binding protein，FK506BP)-Casp8融合蛋白，应用AP20187处理后，这两个融合蛋白形成二聚体，诱导p16INK4A阳性细胞凋亡。p16-3MR转基因小鼠可用于识别、跟踪和选择性地杀死体内p16INK4A阳性细胞。3MR基因能编码由荧光素酶、单核红色荧光蛋白(mononuclear red fluorescent protein，mRFP)和单纯性疱疹病毒胸苷激酶(herpes simplex virus thymidine kinase，HSV-TK)组成的融合蛋白。HSV-TK能将更昔洛韦前药(ganciclovir，GCV)磷酸化转化为有毒的代谢产物，引起DNA损伤，选择性地杀死HSV-TK表达即p16INK4A表达的衰老细胞[6]。

Baker等[8]利用INK-ATTAC清除Bub1b早衰小鼠体内的衰老细胞，可以减轻肌少症、白内障和脂肪萎缩等衰老症状，与敲除p16INK4A基因效果相同，这一成果引起了广泛关注。由于早衰小鼠不能用于评价自然老龄化终点和肿瘤发生，研究人员进而开展了第2项研究，在两种遗传背景(C57BL/6J及129Sv× C57BL/6J×FVB)小鼠中建立INK-ATTAC小鼠，12月龄开始每周2次给予AP20187，结果显示，清除衰老细胞的处理可以延长小鼠中位生存期；在健康生存期间，肾小球硬化、心肌细胞肥大、心脏应激能力下降、白内障及肿瘤等衰老表型有不同程度的减轻[9]。Jeon等[10]利用p16-3MR小鼠模型研究发现，衰老细胞堆积及其所导致的微环境改变在老年关节退行性变中起重要作用。

Xu等[11]发现，给年轻小鼠移植很少量的衰老细胞可以引起老年退行性改变，给老年小鼠移植衰老细胞可以导致生存期缩短。应用衰老细胞清除剂达沙替尼(dasatinib，D)和槲皮素(quercetin，Q)组合清除组织中的衰老细胞，可以降低移植组织中的炎性因子水平，减轻老年退行性改变，延长健康寿命，进一步验证衰老细胞与老龄化的关系。

上述衰老细胞堆积及其清除相关的系列研究，验证了衰老细胞堆积在老年病发生、发展中的驱动作用，为衰老细胞作为老年病的防治靶点提供了一定的基础。

3 衰老细胞清除剂

2011年，Baker等[8]报道，利用基因工程方法清除衰老细胞可以减轻老年性退行性病变以后，研发衰老细胞清除剂成为衰老研究的热点领域。Zhu等[12]发现，不仅衰老细胞内促进细胞存活的相关基因表达增加，而且衰老细胞本身也表现出凋亡抵抗的特性，通过沉默促存活网络的关键基因，可杀死衰老细胞。同时，他们发现，D+Q联合用药可选择性杀伤衰老的脂肪细胞和内皮细胞，并且提出了衰老细胞清除剂的概念，它能选择性杀死衰老细胞。Chang等[13]通过细胞衰老模型筛选小分子化合物，首次发现Bcl-2抑制剂ABT263可以选择性地清除衰老细胞，减轻老年小鼠和全身照射小鼠造血干细胞衰老导致的造血干细胞功能损伤，并且发现ABT263对各种原因导致的衰老细胞均有细胞毒作用。

研究发现，叉头框蛋白O4(forkhead box protein O4，FOXO4)主要在衰老细胞中表达，对衰老细胞的存活起着关键性作用，而在非衰老细胞中几乎不表达。人成纤维细胞受到照射后，p53-FOXO4相互作用引起成纤维细胞衰老，并出现凋亡抵抗特性。研究人员设计了FOXO4-DRI(forkhead box protein O4-D-Retro-Inverso，FOXO4-DRI)多肽，能有效地干扰p53-FOXO4的相互作用，p53解离后引起线粒体内的Cyt-C渗出，进而诱导细胞凋亡。小鼠每周注射3次FOXO4-DRI多肽，连续注射10个月，可以减轻XpdTTD/TTD早衰小鼠和正常老年小鼠的老年退行性改变，并且没有发现任何明显的副作用。短期FOXO4-DRI多肽治疗可以改善肾脏功能，促进毛发生长和体力恢复[14]。UBX0101能够清除衰老细胞，减轻骨关节炎模型小鼠的功能损伤，目前已进入Ⅰ期临床试验，将在下面进行描述[10]。

上述基因工程手段或药物研究均是针对衰老细胞的抗凋亡特性，通过靶向诱导衰老细胞凋亡，进而清除衰老细胞。近年来研究发现，具有清除衰老细胞作用的化合物还有荜拨明碱[15]、A1155463、A1331852[16]、HSP90抑制剂[17]等。

另外，针对SASP的治疗也是抗衰老治疗的一项重要手段，如二甲双胍、雷帕霉素及各种炎性因子抗体等[2]。随着衰老细胞在老年退行性病变和老年病发生发展中的作用机制研究的不断深入，对新药研发、老药新用以及制定用药方案都提出了新的挑战。

4 衰老细胞清除剂临床前研究

目前，临床及临床前研究发现，老年退行性疾病和放化疗患者组织中衰老细胞明显增多。以此开展的衰老细胞清除剂的临床前研究取得了很大进展,尤其是在动脉粥样硬化[18]及骨关节炎模型[10]的治疗中显示了很好的应用前景。

4.1 衰老细胞清除减缓老年病的发生发展疾病动物模型研究结果显示，衰老细胞与阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)[19-20]、骨质疏松[21]、动脉粥样硬化[18]、糖尿病(diabetes mellitus，DM)[22]、肺纤维化[23-24]等老年性退行性病变和老年病的发生有关。而衰老细胞清除剂能够选择性地清除衰老细胞，延长寿命，在老龄化过程中免除慢性疾病困扰，包括减少肿瘤发生，延长中位生存期，减轻动脉粥样硬化、骨关节炎、白内障、心脏肥大、肾衰、脂肪代谢紊乱和肌少症等老龄化改变[18]。

Farr等[21]采用不同方式建立老年相关骨质疏松小鼠模型，通过转基因方式或给予衰老细胞清除剂清除小鼠体内衰老细胞，或者给予JAK抑制剂抑制SASP分泌。他们发现，靶向清除衰老细胞后小鼠骨质增多，骨结构清晰，骨吸收率降低。目前，已有大量的证据表明，骨质疏松动物模型或者骨质疏松患者骨微环境中衰老细胞明显增多，SASP分泌增加，继而导致骨吸收增加，合成减少。清除衰老细胞或者抑制SASP分泌可阻止骨质疏松的发生、发展。

研究发现，骨关节炎患者的软骨中存在衰老细胞，Xu等[25]为了证实衰老细胞与骨关节炎发生的关系，建立了一种新型移植模型。从小鼠耳部软骨中分离出衰老细胞和非衰老细胞，分别注入到小鼠膝关节腔，并进行追踪，发现注射衰老细胞的小鼠出现腿部疼痛，活动受限，以及骨关节炎类似的影像学和组织学改变，提示衰老细胞可能诱导骨关节炎的发生，靶向清除衰老细胞可能成为一项有前景的骨关节炎的治疗策略。Jeon等[10]利用p16-3MR转基因小鼠横断膝关节前交叉韧带建立损伤型骨关节炎模型，发现膝关节软骨和滑膜中堆积大量的衰老细胞，给予GCV清除衰老细胞后，能够延缓骨关节炎的发生、发展，减轻膝关节疼痛并加速软骨再生。同时他们还使用了一种新型衰老细胞清除剂UBX0101清除衰老细胞，UBX0101通过诱导衰老细胞凋亡，减少SASP分泌，从而促进软骨再生并改善关节功能。体外研究也证实了这一观点，他们应用2D和3D技术体外培养骨关节患者的原代软骨细胞，给予UBX0101处理后，原代软骨细胞的MMP-13、IL-6和IL-1β的表达水平均明显降低，UBX0101还能改善骨关节炎模型小鼠的功能指标，提高多聚糖及Ⅱ型胶原蛋白水平，提高关节承重能力。以上研究结果提示UBX0101是具有临床转化潜力的化合物。

Childs等[18]利用低密度脂蛋白受体缺陷(low-density lipoprotein receptor-deficient，Ldlr-/-)小鼠作为研究动脉粥样硬化的模型小鼠，给予Ldlr-/-小鼠高脂饮食88 d后，粥样损伤部位出现SA-β-Gal阳性衰老细胞，主动脉弓斑块部位p16INK4A、p19Arf表达增加，基质金属蛋白酶MMP-3、MMP-13和炎性因子IL-1α、TNF-α等SASP因子分泌增加，低脂饮食喂养的Ldlr-/-则没有这种改变。Ldlr-/-与p16-3MR杂交小鼠(Ldlr-/-；3MR)喂饲高脂饲料，给予低剂量GCV可以降低衰老细胞数目。透射电镜显示，在光镜下斑块中的泡沫细胞是血管内皮样细胞和巨噬细胞样细胞，在胞质内有大量空泡。在启动斑块形成过程中，位于血管内皮下方出现衰老标记阳性的泡沫样巨噬细胞堆积，高水平的表达一些细胞因子，形成斑块病理性改变。动脉粥样硬化斑块中，衰老标记巨噬细胞分泌的炎性因子与斑块的进展和不稳定性有关；清除衰老细胞后斑块明显缩小，晚期斑块的稳定性增加。

特发性肺纤维化近年来发病率逐渐升高，见于各年龄组，而做出诊断常在50～70岁之间，男女比例1.5～2∶1；往往预后不良。早期病例即使对激素治疗有反应，生存期一般也仅有5年，被称为不是癌症的癌症。Schafer等[23]利用博来霉素诱导INK-ATTAC小鼠肺纤维化，发现病变中有衰老细胞堆积，应用D+Q治疗有效。Justice等[26]报道，给予14名轻至中度老年特发性肺纤维化患者服用D+Q进行治疗，每周服用3 d，连续服用3周，患者的活动能力明显提高，虚弱症状明显缓解，对握力和肺功能等其他生理指标没有影响，并且未观察到严重的毒副作用。这是衰老清除剂的首个人体试验结果，具有里程碑的意义。

4.2 衰老细胞清除剂减轻放化疗损伤放化疗是肿瘤常规的治疗手段，放化疗的毒副作用是导致患者终止治疗的重要原因之一，并且严重影响患者的生活质量。

研究发现，照射引起骨髓持久性抑制与造血干细胞出现衰老性改变，并且主要与造血干细胞选择性氧化应激水平升高有关。利用筛选出的小分子化合物ABT263，可以清除受照小鼠体内衰老细胞，受照小鼠造血干细胞功能得到明显改善，并可以减少照射引起的肺组织、肌肉组织中的衰老细胞数目[13]。

FOXO4-DRI不仅可以减轻XpdTTD/TTD早衰小鼠和正常老年小鼠的老年退行性改变，并且可以减轻化疗药物阿霉素体外、体内的毒性作用[14]。体外结果显示，阿霉素可以诱导人成纤维细胞IMR90衰老，表现为SA-β-Gal表达增加，p16INK4A表达水平升高，SASP炎性因子IL-1α和IL-6分泌增加；FOXO4-DRI对阿霉素诱导的衰老细胞有选择性杀伤作用，对阿霉素引起的DNA损伤没有明显的干扰作用，并且对IMR90细胞单用时，毒性明显低于ABT737。应用p16-3MR转基因小鼠发现，全身应用阿霉素引起小鼠肝脏衰老细胞增多，肝功能受损，应用FOXO4-DRI可以减轻阿霉素引起的体质量下降和肝功能损伤，而GCV不能增加FOXO4-DRI的作用，提示FOXO4-DRI的保护作用是通过减少体内衰老细胞介导的。

Demaria等[27]应用转基因小鼠在体追踪衰老细胞，发现化疗诱导产生的衰老细胞在体内持续存在，并且与局部和全身炎症性改变有关。清除衰老细胞可以减轻化疗药物阿霉素和紫杉醇引起的短期和长期毒副作用，包括骨髓抑制、心脏功能损伤、肿瘤复发和体力下降。临床研究发现，治疗前T细胞衰老标志表达水平较高的肿瘤化疗患者疲劳无力的发生率明显升高，与小鼠结果一致。

肺癌逐渐成为危害人类健康重要疾病，发病率逐年增高。放疗是主要的治疗手段之一。放射性肺炎及放射性肺纤维化成为肺癌放射治疗的重要限制因素。Pan等[24]在辐射诱导肺纤维化的小鼠模型中应用ABT263进行治疗，发现ABT263能够有效缓解辐射诱导肺纤维化的发展。进一步研究发现，ABT263可选择性杀死衰老的Ⅱ型肺泡上皮细胞，降低衰老细胞比例。

早期工作表明，外周血T细胞p16INK4A表达升高是人体生理老年的生物学标志[28]。临床研究发现，高剂量化疗特别是烷化剂治疗以及干细胞移植，可以促进患者外周血T细胞p16INK4A表达水平的升高[28]。

上述研究结果提示，清除衰老细胞可能是减轻放化疗毒副作用的新治疗策略。

5 结语

清除衰老细胞或阻断SASP分泌，来阻断衰老细胞的促衰老作用，可能成为治疗老年性疾病的有效策略。实现这一策略，还要面临很多挑战。首先，在一些生理过程中，细胞衰老对机体是有益的，如抑制肿瘤、伤口愈合、胚胎发育、组织再生和促进老年β细胞分泌胰岛素等。所以，使用衰老细胞清除剂治疗的时间、部位和方式都需要慎重考虑。第二，有些化合物在体内可以清除衰老细胞，但是有脱靶效应，如ABT263引起的血小板下降[29]，因此需要对药物进行修饰，增加药物对衰老细胞的选择性作用，降低对非靶细胞的细胞毒作用。第三，由于不同组织衰老细胞的起源不同，易感性也有区别，因此需要针对不同的组织细胞类型，以及衰老细胞堆积特点设计衰老细胞清除剂。最后，降低SASP的表达，需要持续给药维持治疗，这类分子往往具有免疫抑制作用，这样会带来用药安全问题[30]。因此，需要利用不同的模型，观察衰老细胞及SASP的发生发展规律，探讨个性化用药方案。现在抗衰老和靶向衰老发生机制的多种药物进入了临床试验，由于无法进行无病生存期等相关临床观察，研究特异性的生物学标志也是人们关注的热点。衰老细胞清除剂成功转化，将可从机制上对多种老年病和功能衰退进行预防或者治疗，实现一药多治，有助于改善老年人不合理多重用药的治疗现状。