非洲猪瘟病毒分子生物学检测方法研究进展

李天芝，于新友

( 山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600)

非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）为有囊膜的病毒，大小约175 ～215 nm，只有1个血清型。ASFV 为线状双链DNA病毒，基因组大小约170 ～190 kb，两端为可变区， 中间为保守中心， 包 含150 个ORF， 可 编 码150 ～200 种蛋白[1]，其中结构蛋白28 种。根据P72 基因序列的差异，可分为24 种不同的基因型，我国流行的主要是基因Ⅱ型。病毒对外界环境抵抗力强，尤其在湿冷环境可长期存活。ASFV 宿主范围较窄，仅能感染猪致其发生非洲猪瘟(African swine fever，ASF)，临床表现主要为病猪高热、厌食以及皮肤和内脏器官广泛出血[2]。世界动物卫生组织(OIE) 和我国都高度重视ASF，分别把其作为必须通报的动物疾病和一类动物疫病[3-4]。

自2018 年8 月，ASF 在 我 国首次报道以来，迅速席卷全国[5]，不仅给我国养猪业造成严重的经济损失，还造成重大的经济、社会和政治影响[6]。目前尚无有效的商品化疫苗可用，也无有效治疗药物。其所引起的病变与猪瘟及细菌性败血病等病变类似，因此，仅通过剖检有时很难做出正确诊断，需借助实验室方法确诊。抗体检测存在一定的缺陷：一是抗体产生的滞后性；二是抗体检测不能判定现症感染，故一般采取病原学方法进行确诊。由于方法本身局限性及国家相关政策等原因影响，传统的病原分离，间接免疫荧光满足不了临床样本检测的需求，针对ASFV 核酸的分子生物检测方法是最适宜该病检测方法。该病防控主要依靠扑杀感染动物、完善的生物安全措施，为满足现场早期、快速、准确排查ASF 疫情，阻止疫情在国内的进一步蔓延的需求，需借助先进、科学、经济的分子生物学检测方法。笔者综述了ASFV 的6 种分子生物学检测方法研究进展情况，希望为ASF 的诊断及防控工作提供参考。

1 核酸探针

核酸探针主要是基于碱基互补配对的原理，修饰后寡核苷酸探针可与待检核酸单链退火形成双链，利用修饰物进行抗原- 抗体反应，以放大信号，达到检测目标核酸的目的。张鑫宇等[7]等根据GenBank 公布的22 株不同基因型的ASFV p72 基因比对和分析结果，选取保守基因序列，设计并合成一条寡核苷酸探针，探针5′端和3′端分别用生物素和烷巯基修饰，随后将探针吸附到纳米金颗粒上，制成金标记探针。探针与PCR 扩增的p72 基因保守序列进行杂交后，加入包被有链霉素亲和素的酶标板进行反应，后用银染法将信号放大。结果显示，酶标板中可见黑色沉淀，该法检测的敏感度为10 fmol/L ASFV 核酸。

2 纳米PCR

纳米PCR 技术是将纳米材料应用PCR 所形成的一门新兴技术，纳米金粒子的应用可提高酶的活性和稳定性，提高反应效率，改善非特异性扩增现象，提高PCR 检测特异性[8]，缩短PCR 反应时间，使检测更加具有准确性、可靠性。崔尚金等[9]根据ASFV 基因保守序列设计引物，建立了检测ASFV 的纳米PCR 检测方法。结果显示，该法特异性好，仅对ASFV 扩增出特异的552 bp 目的基因，不与猪常见的多种病原如猪瘟病毒（CSFV）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2 型(PCV2) 等核酸发生交叉反应，敏感性高，最低可检测10 个拷贝的质粒DNA 量，检测敏感性是常规PCR 的1 000 倍。

3 多重PCR 法

多重PCR 是在常规PCR 基础发展起来的一种方法，在同一反应体系内加入2 对及以上引物，可实现对多种病原的同时检测，实现临床疾病快速筛查。任梅渗等[10]参考PRV、CSFV、ASFV、PRRSV、副猪嗜血杆菌(HPS)、胸膜肺炎放线杆菌(APP) 以及多杀性巴氏杆菌(PM) 标准毒株序列，选择各病毒和细菌的保守序列分别设计7 对特异性引物进行多重PCR。各项优化试验结果表明，当反应的退火温度为51 ℃，各条引物浓度均为0.8 μmol/L 时，扩增的目的条带效果最佳，用敏感性试验检测该反应中各病毒的最小检出量分别为：1.01×102copies / μ L ( P RV )、1.48×103copies /μ L ( C S F V )、1.07 ×104copies/ μL(ASFV)、9.73×103copies/μL(PRRSV)、1.82×103copies / μL ( HPS )、1.65×103copies / μL ( P M ) 和3.64×103copies/μL(APP)。 在 最 优化的反应条件下进行特异性试验，结果未出现交叉反应，能检出对应病原的多种血清型，阴性对照均无非特异性扩增。冷依伊等[11]根据公布的病原保守基因序列，建立了同时检测ASFV、水疱性口炎病毒(VSV)、猪 口 蹄 疫 病 毒(FMDV)、CSFV 和PRV 的多种PCR 检测方法，结果显示，该法特异性好，对其他猪病原核酸无扩增反应条带；该法敏感性好，对ASFV、PRV、FMDV、CSFV和VSV 的最低检测限度分别为5.71 copies/μL、8.82×103copies/μL、4.32×102copies/μL、6.87×104copies/μL和4.93×104copies/μL，可用于临床样本的快速筛查。

4 荧光定量PCR

荧光定量PCR（qPCR）是将传统PCR 与光谱技术结合发展的一种检测技术，具有PCR 的所有优点，可直接观察扩增结果，不需要后续电泳检测扩增产物，减少了对环境气溶胶污染的可能，避免了假阳性结果，可实现样品的定性和定量检测。据信号基团的不同，qPCR 可以分为染料法和探针法两种。曾少灵等[12]基于ASFV VP73 基因设计引物和探针，建立了检测ASFV 的荧光PCR 方法，并与OIE 推荐的方法进行比对。结果显示，该方法敏感性高，检测限度 为10 copies/μL， 同OIE 推 荐 方法敏感性一致，是常规PCR 的10倍，批内和批间重复性实验的CV值均不高于3.14%，具有良好的重复性。王建华等[13]建立了一种基于CP530R 基因检测ASFV 的TaqMan-MGB 荧光PCR 方法， 结果显示，以质粒标准品做模板，得到的标准曲线方程为y=-3.449x ＋38.10，相关系数为0.999，该方法不仅特异性好，对猪细小病毒(PPV) 、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪流感病毒(SIV)、PRRSV 和CSFV 等 核 酸 扩增结果均为阴性，最低可检测61 个拷贝的质粒标准对照分子，重复性试验变异系数不高于2.0%，方法重复性好。

随后王建华等分别根据ASFV、CSFV 和 高 致 病 性PRRSV 的CP530R、5 ′ UTR 和NSP2 基 因序列，设计引物和探针，建立了同时检测这3 种病毒的多重荧光RTPCR 检测方法，结果显示，该方法特异性好， 不与PRV、PCV2、SIV、PPV 和PEDV 等核酸发生交叉反应，对ASFV 的最低检测限度为61 copies/μL，对CSFV 的最低检测限度为11 copies/μL 和对高致病性PRRSV 核酸的最低检测限度为41 copies/μL。组内和组间变异系数均不高于2.5%，说明方法特异性好[14]。李霆等[15]根据ASFV E184L基因设计1 对引物及相应探针，建立检测ASFV 的TaqMan 荧光PCR方法。结果表明，该方法选择的引物具有高度灵敏性和特异性，以标准品在重组质粒为模板建立的标准曲线线性关系良好，相关系数为0.992，对ASFV 核酸最低检侧限为1.5 拷贝， 且与PRV、PPV、PCV2等多种病原不存在交叉反应。

5 微滴数字PCR

微滴数字PCR (Droplet digital PCR，ddPCR) 是近年来新出现的新型PCR 方法，主要通过油包水的技术原理，将配置的PCR 反应体系，分割成多个纳米微滴，使得每个微滴不含或仅含少量待检的核酸分子，每个微滴均为独立扩增系统[16]，依据泊松原理得出起始模板绝对含量[17]，不依赖Ct 值或内参基因，即可最低定量检测单拷贝的核酸分子，精确性更高。邬旭龙等[18] 根 据ASFV 保 守 的K205R 基因，设计并合成1 对引物及Taq Man探针， 同时建立了检测ASFV 的qPCR 和ddPCR 方法，并对这两种方法从线性关系、敏感性、特异性和重复性等多方面进行评估。结果显示，两种检测方法线性关系较好(R2≥0.998)， 但ddPCR 检 测 敏 感性是qPCR 的10 倍，最低检测限度为10 拷贝/ 反应，而qPCR 的最低检测限度为102拷贝/ 反应，所建ddPCR 检测ASFV 方法特异性好，与PRRSV、CSFV、JEV、PCV2、PRV、FMDV 等核酸无交叉反应，重复性结果显示，该法组内变异系数在2.84% ～5.16% 之间、组间变异系数在3.68% ～5.14% 之间，说明方法重复性好。

6 环介导等温扩增技术

环介导等温扩增(LAMP) 方法由日本学者Notomi 等发明，是一种核酸恒温扩增技术，可用于临床病原分子检测，只需水浴锅或恒温箱等简单设备即能开展实验，通过在反应体系中加入特殊物质使得反应结果肉眼可见，具有灵敏度高、操作简单、反应时间短、临床使用不需要特殊的仪器等优点，特别适合在现场和基层部门应用。王华等[19]建立了检测ASFV 的LAMP 检测方法，结果显示，该法可在62 ℃恒温条件完成检测反应，所用时间为60 min， 对核酸检测敏感性为10 copies/μL， 是 常 规PCR 的100倍，特异性好，不与PCV2、PPV、PRV 等猪常见病原核酸发生交叉反应。田纯见等[20]根据ASFV 高度保守的非结构DNA 聚合酶G1211R 基因设计引物，建立了ASFV 实时荧光LAMP 方法，并与荧光PCR 检测结果进行比对，结果显示，该法检测灵敏度达21 pg，优于荧光定量PCR 方法。 重复性试验LAMP 检测批内和批间变异系数均小于5%。该法特异性良好，与PCV2、PRV、CSDFV、PRRSV 及昆虫核酸无交叉反应。王学庆等[21]根据ASFV 保守基因序列，设计特异性引物，建立一种检测ASFV 的LAMP 扩增方法。该方法能在58 ℃恒温条件下50 min 内完成检测反应，敏感性实验表明，最低可检出5 copies/μL的ASFV 核酸，该法与健康猪样本、PRRSV 和PPV 核酸样本不发生交叉反应，特异性强。所建立的检测方法反应结束后，无需开盖，可避免气溶胶造成的污染。通过肉眼观察反应液颜色变化判读结果，若反应液呈黄色，结果判为阳性；若反应液呈橙红色，结果判为阴性。

7 重组聚合酶扩增技术

重组聚合酶扩增(recombinase polymerise amplification，RPA) 技术是的一种核酸检测新技术[22]，它是由英国TwistDx Inc 公司于2006年成功研发。该技术主要利用3 种酶，重组酶、具有聚合链置换功能的DNA 聚合酶和单链结合蛋白，代替了传统PCR 的热循环解链过程实现核酸快速大量扩增[23]，25 ～42 ℃等温条件下，30 min 内实现对靶基因的指数级扩增，不需要昂贵的仪器设备，产物的检测可通过凝胶电泳、荧光检测仪、侧向流试纸条(LFD)、生物芯片等多种不同方法，具有灵敏度高、特异性强、检测时间短、结果读取多元化、操作简便等优点。能满足疫病快速现场检测的需求。王建昌等[24]根据ASFV 保守性强的p72 基因序列，设计RPA 引物，建立了检测ASFV 的RPA 检测方法。 结果显示，该方法可在38 ℃恒温条件下30 min 内完成检测反应，该方法检测敏感性高，与OIE 推荐测荧光PCR 检测方法一致，对含p72 基因重组质粒的最低检测限度为100 拷贝，特异性检测表明该法特异性好，不与口蹄疫病毒(FMDV)、CSFV、PRRSV、PRV 和PCV2 等核酸发生交叉反应。哈登楚日亚等[25]设计了3 对针对ASFV p72 基因的引物和探针，优化反应条件后，选取最佳的1 对引物和相应探针，建立了ASFV 的RPA 检测方法。结果显示，该法20 min 内完成检测反应，全程反应温度维持39 ℃恒温，特异性好，与CSFV、PCV2、PPV、PRV 等核酸均无交叉反应，最低检测限度为10 拷贝。吴映彤等根据ASFV 多基因家族成员MGF360-12L 基因序列，设计引物， 建立了ASFV RPA 等温检测方法。结果表明，所建立的RPA 方法于35 ℃恒温反应30 min，即可实现对目的片段的稳定扩增，以含有MGF360-12L 基因的重组质粒为模板，RPA 反应的检测限达到103个拷贝，同普通PCR 方法检测限一致。此外，该法特异性好，仅对ASFV 核酸有阳性扩增结果，对PEDV、FMDV、CSFV、PRRSV、PRV 和PCV2 核酸均无扩增。

林彦星等根据ASFV 基因组中序列保守稳定的B646L 基因设计特异性引物和探针，建立了ASFV 核酸RPA 快速检测法。结果显示， 该法特异性强， 能准确 检 测ASFV 核 酸， 与CSFV、PRRSV、PCV2、FMDV、猪A 型塞内卡病毒(SVA) 等灭活病毒核酸无交叉反应，敏感性高，最低可检测到2×101copies/μL， 检测时间短，15 min 即可完成反应，且具有很好的重复性。缪发明等[26]建立了一种简便、快捷的现地检测ASFV 的方法， 该法联 合RPA 和LFD 技术，针对ASFV P72 基因保守区域，设计两条引物和一条nfo探针，下游引物5′端标记生物素，nfo 探针5′端异硫氰酸荧光素或6-羧基荧光素，3′端带有阻断物，序列内部标记THF 分子，通过引物浓度、RPA 反应时间和温度等条件的优化建立了一种可以用于ASFV 现地检测的RPA-LFD 方法。该检测方法在38 ～46 ℃恒温反应10 min即可实现对ASF 目的基因的有效扩增，与CSFV、PCV2、猪乙型脑炎 病 毒（JEV）、PEDV、PRRSV、PRV 等均无交叉反应。RPA 扩增产物直接用LFD 肉眼观察，最低检测限为102拷贝/ 反应，灵敏度与TaqMan 荧光定量PCR 相当。

8 小结

非洲猪瘟是国际公认对养猪业危害最严重的疾病，世界各国均高度重视，猪场一旦发病，按国家政策应全部扑杀。目前该病在我国全国均有流行，给养猪业造成毁灭性打击，使养猪人丧失养猪信心。我国是以散户为主的养殖模式，居民普遍喜食热鲜肉，由此产生大规模生猪调运，注定非洲猪瘟的防控工作必将是一场持久战。虽然该病已流行近百年，但对其致病机理尚不明确，因病原独特性质，疫苗研究未取得突破性进展，甚至其消毒剂及诊断制品的研究还不完善，还有大量工作要做。该病虽然在全国范围多点散发，但传播速度非常慢，早期诊断后，通过相应的消毒及生物安全防控措施可将猪场损失降低。为开展非洲猪瘟分子流行病学调查，了解病毒传播途径，掌握疾病流行动态，防止疫情扩散和蔓延，需依靠大量快速、敏感、成本低、操作简单的高质量检测试剂。

当前ASFV 分子生物学检测方法有多种，但各有利弊，探针检测法虽然可实现高通量检测，一次可检测大量样本，但操作较复杂。纳米PCR 方法虽然检测速度快、敏感性高、特异性强，但不能实现对病原的定量检测，且纳米材料不易获得。多重PCR 方法，虽然可实现对多种疾病的快速筛查，但因所用引物众多，反应条件很难兼顾，致检测敏感性不高，易导致漏检。荧光PCR 检测方法较成熟，检测速度快，可实现病原定量检测，但染料法特异性不好，很难筛选到好的引物，探针法探针合成价格较贵，且需要价格昂贵的仪器设备，很难在基层大面积推广应用。LAMP 方法虽然简单、方便，适合基层进行推广应用，但引物设计复杂，且灵敏度太高，易出现假阳性结果，对非特异性扩增也很难鉴别。微滴数字PCR探针的设计同荧光PCR，原理复杂，操作过程对人员要求高，无需标准曲线，最低可检测单拷贝核酸分子，可实现待检靶样品核酸绝对定量，目前普及程度不如荧光PCR，同样不适合基层检测。重组聚合酶扩增技术所用试剂价格昂贵，检测成本高，引物设计规则不明。

当前，对ASF 无有效疫苗和治疗药物可用，只能靠严格的生物安全措施防控，制定严格标准，并严格执行，规范引种与卖猪流程，进出车辆严格消毒。人员按规定隔离、消毒和换洗衣物。加强猪饲养管理，提供适宜温度、湿度，降低猪只饲养密度，猪舍分割成小单元饲养，减少猪群应激。进出猪场饲料、药品、疫苗、物资等严格熏蒸消毒，猪舍定期清理粪尿，做好灭蚊蝇及灭鼠工作。选择质量有保证的厂家对ASFV 有确定效果的消毒剂，如过硫酸钾复合物、戊二醛等，消毒剂配制浓度要合理，保证消毒时间，并注意外界环境温度，部分消毒剂在低温环境无效。

因我国流行的ASFV 为强毒株，猪群常在抗体还未产生或抗体滴度不高时猪只已死亡，全球对非洲猪瘟都是扑杀政策，所以当前检测抗体的意义并不大，主要针对抗原检测。随着疾病的流行，ASFV 可能会变为弱毒株，猪只出现隐性带毒情况，到时检测抗体可能更有意义。虽然针对ASFV 病原检测方法有多种，但当前国家推荐的检测方法是荧光PCR，国家农业农村部组织了比对，推荐了一些质量符合要求的厂家。检测时可选取全血、血清、唾液、粪便、扁桃体、淋巴结、脾脏等样本，通常唾液中最早出现病毒，适合疾病早期筛查，一定要把握检测时间，早发现、早剔除，减少猪舍中病原载量，否则可能就没有意义。另外对检测的唾液样品最好不离心、不冻融，尽早检测，以提高检出率，否则可能会因核酸降解及病毒量减少造成漏检。活体检测排查针对病原可采集血样，采样时一定要防止猪只间交叉污染，全血的检出率要高于血清。

虽然公认病猪脾脏为检测的最佳组织，但一般不建议对疑似发病猪只解剖，以免造成大的污染面，可在腹股沟淋巴结切开一小口，取少量淋巴结检测。如果条件允许的话不要选择免核酸提取试剂盒，免核酸提取试剂盒虽然对病毒含量高的样本扩增无影响，但对环境采样或对病毒含量低的样本，少了核酸的富集和纯化过程，必然会减少样本阳性检出率。核酸手提法操作繁琐，时间长，对人员和仪器设备要求高，商品化核酸提取试剂盒分为柱式提取法和磁珠提取法两种，磁珠法更适合大量样本用核酸自动提取仪提取，不同厂家柱式法试剂提取效率不同。便携式荧光检测试剂及适合常温保存和运输的试剂在基层疾病的诊断中必将发挥巨大的作用。相信，随着技术的不断进步，科研工作者一定会开发出更多价廉、质优的检测试剂，以满足基层猪场及实验室检测需求，从而更好地防控非洲猪瘟，减少猪场损失，保障我国养猪业的健康发展。