当归头与尾阿魏酸代谢模式研究初探❋

杨 杰，张 瑜，万 斌，范光忠，彭启伦

(1.毕节医学高等专科学校，贵州 毕节 551700； 2. 重庆医药高等专科学校，重庆 401331； 3. 重庆市中医院，重庆 401331)

当归作为“血中之圣药”，不同药用部位的功效明显不同，但是不同药用部位临床疗效差异的科学依据，尚待深入揭示。我们认为，当归头与尾功效差异源于次生代谢产物含量的差异，次生代谢产物含量差异源于酶含量与活性差异，而酶活性差异的根本原因是相关基因群的差异表达。基于该研究思路，由于当归头与尾阿魏酸含量差异被相关文献数据证实，并结合课题组前期研究基础，因此本文以当归主要活性成分阿魏酸的代谢调控为切入点，深入探讨当归不同药用部位药效成分代谢调控的生物学机制。

1 当归头、归身、归尾功效不同临床运用考究

当归不同部位入药的功效差异被广泛阐述，尤以李东恒“头止血而上行，身养血而中守，梢破血而下流，全活血而不走”之描述最为精辟。明代著名医家李时珍指出：“治上用头，治中用身，治下用尾，通治全用”，对当归不同部位功效差异做出了重要论断，后世医家对此有所发挥。如治疗中风后遗症的补阳还五汤(《医林改错》)以归尾活血，有祛瘀而不伤血之妙；仙方活命饮(《校注妇人良方》)用归尾解毒化瘀；血府逐瘀汤配以归尾益气活血，通窍明目；犀角地黄汤以归尾破血逐邪，俾瘀血破而邪热透[1-4]。因此，当归不同药用部位的功效差异，具有重要的临床意义。

严辉等[2]应用中药方剂数据库挖掘当归不同入药部位药性特点及其适应症的变化规律，发现归尾主要应用于活血(52.2%)，归头因临床应用方少而功效取向性不明显；当归头与尾功效差异主要表现为活血功效，而活血差异源于活血药效成分含量的差异，如阿魏酸、藁本内酯等。阿魏酸是当归主要水溶性活性成分，常作为当归质量鉴定的标志性化合物，具有抑制血小板聚集、抗血栓及心脏保护等药理活性[5-7]。因此，当归头与尾功效差异与主要水溶性活性成分阿魏酸含量差异密切相关。

2 当归不同部位、不同生长期的药效成分谱存在明显差异

2.1 当归不同部位药效成分谱差异悬殊

已知当归药效成分包括挥发油成分、水溶性成分、微量元素等类型近100种。当归头与尾功效差异源于药效成分谱差异。吴国霞等[8]采用HPLC-MS分析全当归、当归头、当归身及当归尾所含化学成分，并定性鉴定出色氨酸、绿原酸、阿魏酸等8种当归药用成分，其相对含量在当归不同药用部位中存在显著差异。裴建云等[9]应用GC-MS联合技术检测，然后采用正交投影法分别定性鉴定出67种当归挥发油化学成分，其含量比较差异有统计学意义。吴国霞、杨秀娟等[10]采用HPLC及分光光度法测定阿魏酸含量，建立基于灰色关联度模型的当归不同药用部位的质量评价模式，并发现当归尾相对关联度为0.576，高于当归身和当归头样品。上述研究采用不同分析方法，从不同角度证实当归头与尾药效成分谱存在较大差异。

2.2 当归药效成分谱在不同生长时点存在明显差异

当归属伞形科多年生草本植物，其药效成分的形成与当归生长期密切关联。杨应文等[11]应用1H-NMR法研究当归多糖、阿魏酸和藁本内酯等3种当归活性成分随生长过程的相对含量动态变化，发现第1年变化比较平稳，在第2年和第3年变化比较快速。肖宇奇等[12-13]采用HPLC法分析不同生长期当归化学成分的动态变化，发现在传统的采收期水溶性成分阿魏酸含有量最高，而Z-藁本内酯等挥发油成分的含有量并不比其他生长期高，提示当归次生代谢产物的积累与生长周期相关。上述成果为进一步揭示当归阿魏酸代谢模式、提高药材品质提供了有力依据。

3 当归阿魏酸代谢调控与酶活性密切相关

阿魏酸是桂皮酸的衍生物，以水溶态、脂溶态和束缚态等3种状态存在。水溶态阿魏酸存在于植物细胞质中，与单糖、多胺等小分子物质结合呈易溶态；脂溶态阿魏酸与甾醇等脂溶性物质结合，主要存在于植物表面蜡质层中；束缚态阿魏酸以酯或醚的形式，与多糖、木质素等细胞壁物质相结合。阿魏酸是广泛存在于植物界的一种酚酸，在当归、川芎等中药材中含量丰富，在咖啡、谷壳、玉米皮之中也含量较高。阿魏酸为当归、川芎等中药材的主要活性成分，中国药典将其作为这些药材质量评价的主要指标。

阿魏酸广泛用于药品、食品、化妆品，对其次生代谢产物的调控机制研究，具有重要的学术意义与应用指导作用。PB路径是阿魏酸、木质素、桂皮酸、查耳酮等药效成分合成与降解的主要网络。与阿魏酸代谢密切相关的PB子路径主要有2条：由苯丙氨酸经苯丙氨酸氨裂解酶(PAL)、桂皮酸-4-羟化酶(C4H)合成咖啡酸和阿魏酸，阿魏酸又可经阿魏酸-5-羟化酶(F5H)代谢成5-羟阿魏酸[14-15]；阿魏酸经4-香豆酰-辅酶A连接酶(4CL)、桂皮酰-辅酶A还原酶(CCR)等作用，生成松伯醛和松伯醇，最终生成木质素[15-17]。第一条路径可生成咖啡酸和阿魏酸等活性物质，咖啡酸具有抗炎和免疫调节作用，阿魏酸具有抗血栓等作用；第二条路径产生松伯醛、木质素等无药理活性物质。应用分子生物学技术，可抑制PB路径下游的阿魏酸分解酶，使阿魏酸超量积累而又不增加木质素(灰分)含量，进而提高当归、川芎等药用价值。

4 当归头与尾转录组研究处于起步阶段

4.1 当归的基因组研究可追溯到当归品种的分子鉴定

2003年，张西玲等[18]通过测序技术建立甘肃当归种子rRNA基因图谱，揭开了基因水平研究当归品质及分子药效作用序幕。于光等[19]用cDNA-AFLP等技术分析岷归花蕾与发芽枝条顶端分生组织中的差异表达基因，发现DNA结合转录因子、山梨醇-6-磷酸脱氢酶等参与岷归抽薹的分子调控。阎梦颖等[20]利用DNA条形码trnL-F以及ropC1序列对当归及其混伪品进行鉴别。

4.2 当归头与尾差异表达基因已初步揭示

本课题组[21-22]率先采用Illumina HiSeq 2000高通量测序平台，对岷县当归采收期之归头与归尾完成转录组学比较研究，获取了63585个当归功能基因序列(unigenes),并发现当归头与尾基因表达存在明显差异。通过与UniProt蛋白数据库进行blastx比对，发现已注释的当归基因序列主要分布于目前研究较深入的葡萄、毛果杨、大豆、苜蓿、拟南芥等7种重要经济作物中，为阐明栽培当归的起源物种提供了理论依据。本研究识别了与当归重要药效物质(阿魏酸、当归多糖、当归总黄酮等)生物合成相关的基因序列，初步揭示了与当归补血、活血物质及部分代谢路径调控相关的基因序列。该阶段性研究成果表明，Illumina HiSeq 2000等转录组测序技术，可用于探测诸如当归等基因组研究缺乏物种的功能基因及其网络调控模式[21-25]。

4.3 当归不同部位阿魏酸代谢及PB路径基因群呈时空表达性

本课题组研究了采收期当归根的转录组特性，发现当归根的差异表达基因与PB路径相关，生物信息学分析发现，采收期当归根部表达的127、69、70个unigenes分别映射到PB生物合成、N-聚糖生物合成、黄酮类生物合成等路径，可能参与阿魏酸、当归多糖、当归总黄酮的生物合成及代谢调控[21-22]。雒军等[25]发现，PAL酶的编码基因在当归叶片中的表达量是当归根部的7.5倍，并对当归COMT酶编码基因序列进行了生物信息学分析[26]。温随超等[27]发现，4CL酶编码基因在当归幼苗中的表达具有明显的时空表达性。虽有起步，但当归众多PB路径关键酶的基因结构与功能特征仍不清楚，PB等路径在长达5个月的当归成药期的动态表达模式与调控规律亟待阐明；归头、归尾与当归地上等部分的PB路径基因群动态表达与调控模式，及其与药效成分的动态积累模式交互作用机制有待揭示。

4.4 当归活性成分代谢及其调控基因研究有待于进一步探索

参与阿魏酸等近100种当归活性成分合成与分解的酶及其基因结构与功能研究，仍处于起步阶段[21-22]。转录组学所获得的大量unigenes仍欠缺完整的基因全长序列信息，药效相关次生代谢产物的基因调控及其调控机制尚待阐释，代谢相关基因与环境胁迫性、药材道地性之间的关联性仍需深入研究。仅就转录组学研究而论，本课题组的研究亦不十分完整。众所周知，岷县当归成药期分为茎生长期、根膨大期和采收期等3个生长时期；在长达5个月的药效成分积累之中，当归头与尾连续发生复杂而精巧的转录组学变化，各时期均对阿魏酸等药效成分代谢产生重要影响。

5 RNA-seq、RACE等转录组学技术有助于当归现代化研究

5.1 RNA-seq等技术快速引入中医药研究，并不断取得重要成果

转录组学是一门在整体水平上研究基因转录及其调控规律的学科，是研究细胞表型和功能的重要手段。基于Illumina HiSeq 2000等高通量测序平台的转录组测序(RNA-seq)赋予了生命科学研究人员超强的覆盖度和灵敏性，能够更加准确、快速地提供更多的生物体转录信息,在中医药领域的应用日益广泛[21-27]。陈士林等[28-31]采用高通量测序技术，对人参、西洋参、三七、柴胡、天麻、东北红豆杉、银杏、喜树、丹参等主要药用植物完成大规模转录组研究，发现200多个参与生物碱、萜类、黄酮、酚酸类骨架合成相关的酶基因，及2000多个参与上述化合物骨架修饰的修饰酶候选基因。孙同玉等[23]从高通量测序得到的unigenes基因注释信息中，挖掘出与赤霉素代谢相关基因PqGA2ox的编码区序列，有助于深入西洋参种子解除休眠的分子机制。张绍鹏等[32]对珍稀药用植物珠子参药用部位进行转录组测序,确定其与三萜皂苷合成代谢相关的候选基因，对于阐明人参皂苷合成方式提供了重要的研究基础。通过转录组测序来挖掘药用植物特有生物合成关键酶的基因，解析其生物合成机制，已成为当前中药材功能基因研究的发展趋势之一。

5.2 RACE技术是较为可靠的获取基因编码区序列的实用技术

运用RNA-seq 等获得的unigenes通常是小于700 bp的基因片段，而非完整的基因编码序列。欲从转录组研究结果之中获得完整的基因编码序列，通常可选择以下策略：将转录组的unigene与数据库中该物种EST序列组装(电子克隆)；对于已完成基因组测序的物种，如拟南芥和水稻，可直接将感兴趣的unigene与参考基因组进行比对，以获取该基因的全部信息，进一步分析其可能的转录本序列；采用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends, RACE)，可有效地延伸unigene所缺的5′端或3′端序列。前两种方法实施的前提是，所研究对象的基因组学信息丰富的物种。但是，当归、人参等绝大多数药用植物属于非模式物种，基因组与核酸序列信息较少，电子克隆或直接比对的方法并不适用，RACE技术则是较为可靠的获取药用植物完整的基因编码区序列的实用技术。

5.3 采用RACE技术研究中药活性成分代谢基因业已取得部分成果

RACE是一种从低丰度转录本中快速扩增cDNA的5′和3′端的有效方法，由3个连续的酶促反应步骤(反转录、同聚物加尾和PCR扩增)完成，以其简单、快速、成功率高、廉价等优势而日益受到重视[33]。如刘荣华等[34]采用RACE技术从苦荞中获得C4H基因cDNA克隆；刘建福等[35]将RT-PCR和RACE相结合，对姜黄PAL基因全长进行克隆，为阐明姜黄次生代谢产物的生物合成机制、改善该药材品质提供了科学依据。

6 结束语

药用植物次生代谢物种类繁多、代谢途径复杂、相关基因序列与功能信息非常缺乏。但是充分应用RNA-seq、RACE等转录组学相关技术，有助于捕捉其转录学特征，阐释药效成分代谢调控网络，鉴定代谢产物生物合成的新基因，从分子遗传学层面对参与生长发育和次生代谢基因进行系统研究，进一步阐释药效成分形成的分子机制。