H6N6亚型禽流感病毒进化演变及跨种属传播研究进展

流感病毒属于正粘病毒科，根据其核蛋白(nucleoprotein，NP)和基质蛋白(Matrix protein，MP)抗原性的不同，可分为甲(A)、乙(B)、丙(C)、丁(D)四型。其中，A型流感病毒又根据血凝素(Hemaglutinin，HA)与神经氨酸酶(Neuraminidase, NA)的抗原性不同，可将其分为18个HA亚型和11个NA亚型[1-3]，不同的HA与NA类型之间可任意组合成不同亚型的流感病毒。A型流感病毒属分节段、单股负链RNA病毒，病毒基因容易发生突变和基因重配，进而进化演变成新型流感病毒，其中病毒基因重配过程复杂且不可预测，给流感病毒的监控带来巨大的困难。多年来，禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV) H5N1、H5N6、H6N1、H7N9、H9N2、H10N8等相继从禽类跨物种间屏障直接感染人[4-9]。令人担忧的是，H6病毒在禽类普遍流行甚至直接感染人，并易与其它流感病毒亚型发生基因重配，形成感染人类的新型禽流感病毒H5N1、H5N6[5-6, 10]，对人类健康造成潜在巨大的威胁。

H6N6亚型AIV因其属低致病性禽流感病毒(Low pathogenic avian influenza virus, LPAIV)而一直未引起重视。然而，H6亚型禽流感宿主广泛，在绝大部分野生或家养禽类动物中均可分离到H6亚型流感病毒，并且经常与H5N1、H9N2同时存在于家禽动物体内，这给H6亚型流感病毒的基因重配提供了机会，或者为其他亚型流感病毒基因变异提供基因供体。因此，在流感病毒进化过程中，H6N6亚型AIV有可能是新型重配病毒的先祖。另外，近几年陆续有报道指出H6N6亚型AIV可以感染小鼠、雪雕、猪等哺乳动物，甚至在健康人群中检测到H6亚型AIV的血清特异性抗体[11-13]。以上事实说明了H6N6亚型AIV不仅从禽类跨种间感染哺乳动物的能力，甚至也有可能感染人的潜在危险。

1 H6N6亚型AIV起源和在禽类动物流行情况

1965年，首次从火鸡分离到H6流感病毒亚型[14]，此后从野生水禽和家禽陆续分离到H6病毒，并且在这些宿主分离率逐渐升高[15]。在北美洲连续监测26年显示野生水禽动物中H6是分离率最高的亚型[16]，欧洲的德国和荷兰进行长达9至12年的监测发现H6亚型是欧洲水禽动物最常见的亚型[15, 17]，中国南部和东部，H6亚型是3种最常见的亚型[18-20]。2000年，H6亚型病毒在美洲与欧亚之间出现洲际传播，在瑞典分离到的H6病毒为来自北美病毒谱系的5个基因节段和来自欧亚病毒谱系的3个基因节段重配而成[21]，进一步的大规模分析表明，欧亚H6病毒在20世纪70年代初至2000年代中期曾多次传入美国[22]，此后，欧亚H6病毒开始在北美洲水禽中流行并逐渐成为那里的主要谱系[23]。目前，H6亚型AIV已广泛存在于世界各地，其主要分为北美分支和欧亚分支，其中欧亚分支又可分为I组(ST339-like)、II组(ST2853-like)、III组(HN573-like)。在中国活禽市场，H6病毒，包括H6N1、H6N2、H6N5、H6N6、H6N8感染家禽并在其流行好长一段时间[20, 24]。调查显示，2002-2008年我国的H6亚型流感病毒主要是H6N2亚型，但是自从2009年H6N6亚型出现后，2种病毒并存于活禽市场，进而H6N2亚型逐渐被H6N6取代[20, 25-26]。病毒基因序列分析发现，该两种亚型的病毒均属于欧亚分支，且H6N2亚型AIV与传统病毒一直有高度同源性，但是H6N6亚型AIV则是一株新的重组病毒，其中的PA片段来源于H5N2或H5N6病毒[27]，同时 2014年在四川首次出现的人感染H5N6亚型AIV病例中，经分析发现H5N6亚型病毒的NA片段来源于H6N6亚型病毒[28]，故可认为2株病毒之间相互促进对方的重配。

以前研究表明，鸡是AIV向人类传播的潜在中间宿主，并可能产生具有流行潜能的新型流感病毒[29-30]。2014年1月至2015年7月，Wu等[31]在浙江家禽市场中共分离出12株H6N6禽流感病毒，进化分析表明，这些H6N6 AIV的HA基因与2000—2014年东亚流行的II组(ST2853-like)密切相关。 NA基因进化分析表明，浙江省有2个不同的基因型共流行，其中第I组包括A/Ck/ZJ/110102/2015(H6N6)、A/Ck/ZJ/110144/2015(H6N6)和A/Ck /ZJ/74154/2015(H6N6)，这些病毒与H6N6和H5N6病毒密切相关，并且在NA茎区中缺失11个氨基酸(位点59-69)。这些结果与以前的研究结果一致，即来自家禽的H6N6病毒可以作为先祖，通过基因重配产生新感染人的高致病禽流感病毒H5N6。一些H6N6 AIV是重配病毒，这些重配病毒从中国家禽H6、H9和H10亚型病毒中获得了基因，此结果也为中国东部H6亚型AIV的活跃演化提供了更多的证据，同时考虑到分离的H6N6病毒是从鸡中分离出来的，鸡可能在产生新的H6N6 AIV中起重要作用。所有鸡源H6N6病毒的HA裂解位点模式均为PQIETR/GL，显示单个碱性氨基酸切割位点的特征，属低致病性病毒。HA受体结合位点为Q226和G228，提示这些H6N6倾向与禽型SA-2，3-Gal受体结合。S137N、D19V和G228S突变有利于流感病毒与人型受体的亲和性，在H6N6亚型 AIV中没有观察到S137N和G228S突变，而在A/Ck/ZJ / 727009/2014(H6N6)、A/ Ck /ZJ / 727023/2014(H6N6)和A/ Ck /ZJ / 727028/2014(H6N6)分离株中观察到D19V突变，但目前尚不清楚这是否改变流感病毒对受体的亲和力。PB2 E627K 能提高多聚酶活性，促进病毒复制，增强病毒对哺乳动物的致病力，但在H6N6 AIV的PB2中未观察到这些替换。然而，Zou[26]等应用受体结合特异性分析，发现一些H6N6 AIV已经获得了识别人型受体的能力，同时通过生长动力学实验证实，某些H6N6病毒在哺乳动物细胞中复制能力比其它病毒更强并获得更高的滴度，表明病毒与人型SA-2，6-Gal受体结合增强，与其在哺乳动物细胞中病毒复制增加相关。因此，在家禽流行的H6N6 AIV是否获得了识别人型SA-2，6-Gal受体的能力，仍需进一步深入研究。

2 H6N6亚型AIV跨种属感染哺乳动物

H6N6亚型AIV在野生禽类动物和家禽的广泛流行、进化演变，该病毒有跨种间屏障感染哺乳动物的潜能。动物感染试验表明，一些H6N6病毒无需适应就可在哺乳动物小鼠有效复制[11, 31]。2011年华南农业大学首次报道[13]在中国南方分离到猪源H6N6病毒A/SW/GD/ K6 / 2010(GDK6)，基因进化分析表明该病毒来源于家鸭，GDK6病毒的HA属于H6欧亚分支II组病毒，是华南家鸭中主要流行的H6病毒。该病毒的NA、PB1、PA、NP、NS和MP也来自水禽。PB2基因与H5N1高致病性禽流感病毒具有较近的亲缘关系。在同批次样本中还分离获得H1N1、H1N2、H3N2、H9N2等亚型病毒，表明了H6N6具有在自然条件下感染猪的能力以及猪可以同时感染不同的流感病毒亚型，不同亚型病毒在猪体内有可能重配成新亚型病毒并跨种间屏障传播到人类的风险。血清学调查发现中国南方猪血清H6抗体阳性率为3.4%[13]。随后，从中国东部的猪中也分离出另一株H6N6病毒[32]。Tan等[11]用GDK6病毒在小鼠肺组织反复传代获取小鼠适应型猪流感病毒A/SW/GD/ K6 /2010(H6N6)[GDK6-MA]，该变异病毒显示出比野生型病毒(GDK6)更强的毒力。在GDK6-MA病毒中发生了PB2(E627 K)、PA(I38M)和HA(L111F、H156N和S263R)氨基酸替换。HA的 H156N突变导致MDCK细胞上的空斑增大、病毒在哺乳动物细胞的早期复制增强。PA(I38M)提高了病毒的体外聚合酶活性，但并没有改变病毒在哺乳动物细胞或小鼠的复制活性。这些单一突变仅对毒力有限的影响。然而，GDK6中HA(H156N、S263R)与PA(I38 M)同时突变可产生毒性更强的突变病毒体。显示这些突变可以起到PB2(627 K)突变一样的作用，揭示了H6N6病毒在小鼠致病性方面的新决定因素，这也可能对人类健康构成威胁。应用反向遗传技术重组病毒，HA中A222V突变，尤其是G228S突变，有助于H6N6病毒与SA-α2,6-Gal受体结合，感染人的H6N1和猪流感H6N6中均出现S228保守性，这表明G228S突变可能促进H6向猪或人的传播[12]。同时，动物实验表明，通过直接接触或吸入含病毒的雾化液滴途径，该病毒可在雪貂之间有限的传播。含有2009年新甲型H1N1病毒内部基因的重组H6N6病毒可增加H6N6病毒在雪貂的下呼吸道的复制，但并不出现病毒在雪貂之间的相互传播[12]。这些结果表明，目前猪源流感病毒H6N6对公众健康构成一定的风险，我们应密切监测其进化和传播方向。

3 H6N6亚型AIV跨种属感染人的潜能

禽流感病毒H6N6宿主范围从禽类扩大到哺乳动物并在其体内有效复制，促使病毒可能跨越物种间屏障传播人，对人类健康呈潜在威胁。应用血清流行病学调查发现，美国火鸡场暴露人群，如工人和兽医，其血清中H6抗体阳性[33-34]。中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所Li等[35]检测15 689例活禽市场工人、家庭家禽饲养户农民、大型家禽饲养户农民、家禽屠宰厂工人、野鸟栖息地工人等多个人群血清中H6抗体，发现阳性率为0.4%，其中活禽市场工人的抗体阳性率高于大型家禽饲养户农民，提示人群已被H6亚型禽流感病毒感染，同时活禽暴露是禽流感病毒H6感染人类的主要危险因素。H6N6亚型病毒在欧亚特别我国禽类普遍存在，该病毒虽属低致病性，但容易与其它流感病毒亚型发生基因重配，充当感染人类的新型禽流感病毒的先祖。2014年，中国、老挝和越南家禽暴发高致病性禽流感病毒H5N6亚型，同时发现该病毒感染人类。基因进化分析H6N6病毒为新出现、感染人类的禽流感病毒H5N6提供了NA基因节段[36]。

4 展 望

H6N6亚型AIV仍属低致病性流感病毒，仅引起轻微临床表现，但是最近几年流行病学调查显示，H6N6亚型AIV在家禽中的分离率逐渐升高，并易与其它亚型的病毒发生基因重配形成新型流感病毒。令人担忧的是，该病毒的进化与传播速度快，目前其宿主范围已扩展到哺乳动物并在其细胞内有效复制，促使病毒可能跨越物种间屏障传播人，对人类健康构成严重威胁。禽流感病毒由特异性感染禽类转变为特异性感染人由病毒多个关键基因决定，特别是HA受体结合特异转变是流感病毒感染不同物种的先决条件，位于HA蛋白头部的受体结合位点(Receptor binding sites, RBS)，其主要由190位螺旋、130位环和220位环3个结构域组成，具备典型的结合人型受体SA-α-2,6Gal的特征为HA蛋白的226位为L，228位为S[37]；PB2的627位氨基酸是甲型流感病毒宿主范围以及病毒致病力的重要决定位点，当627位为赖氨酸时毒株致病力强，更适合于感染人类，627位为谷氨酸时毒株致病力弱[38]。我们可通过监测这些流感病毒的关键氨基酸变异来预警禽流感病毒跨种属传播，但是不同亚型流感病毒改变宿主嗜性的分子机制并不相同。因此，深入研究H6N6亚型AIV的起源、进化和传播方向、宿主范围的变化，特别是探索感染人的多个关键基因的变化，为H6N6亚型禽流感病毒的防控提供科学依据。