局灶性脑缺血动物模型的制备探究*

刘 勇 魏鑫甜 陈 伊

（黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150036）

神经系统疾病中以脑卒中较为严重，特别是缺血性脑卒中，因其较难控制的发病、致残、致死性质［1］，已然成为最严重的神经系统疾病之一。近年来研究者发现，治疗脑卒中的难点在于针对其发生的病理与生理学机制并提出合理的治疗方案［2］。缺血性脑卒中的动物模型对于探究缺血性脑血管病的发生机理和治疗预防非常重要［3］，脑缺血动物模型分为2类：弥漫型和局灶型。第一种由于对全身影响大，而且梗死区域不稳定较难定位，故在研究中应用不多［4-5］。第二种由于其可在特定脑区形成梗死灶并可进一步研究再灌注损伤，而且对全身影响较小，较相仿于人类脑卒中，是探究缺血性脑卒中防治的先进方法［6］。由于传统脑缺血模型具有一定局限性，近年来研究者对传统模型进行改进，力求高可重复性、高成功率、高易行性的新型模型，并已取得一定的进展。

1 模型中动物的选择

遵循探究目标挑选最为适宜的动物，建立与人体脑卒中最为相仿的疾病模型对于研究脑缺血疾病发病机理和防治手段有着关键效用。尽管脑缺血模型与实际案例之间存在差异，但通过严格挑选与仔细斟酌，相似于人类脑卒中的动物模型［7］仍对科研及临床发挥重大效用［7］。据相关研究表明［8］，局灶性脑缺血动物中，可选动物种类有非人灵长类动物、啮齿类动物、非啮齿类动物3大类。

1.1 选择原则 原则为应采取同人体解剖学构造、生理学代谢及病理学特性等相仿的动物［7］。留意人体与模型对相同处理的差异，采用具有简单结构又能清楚反映试验指标的动物；选用动物为具有所研究疾病的近交动物或突变动物。在不影响实验的情况下采用符合条件的标准化动物，且易取得性、经济性高者为佳。

1.2 实验动物种类及优缺点 非人灵长类：如狒狒和猴，其具有与人非常相仿的高级中枢发达程度，对药物、机能、结构、代谢等方面优于其他哺乳类动物，但费用高、来源不易、饲养难［8］。猪：家猪的脑血管解剖构造、血流代谢等方面同人体相仿，而且较少的侧支循环适宜基础方向研究［9］，但体型大，品系不纯，并且由于猪丰富的脑动-静脉吻合网而不利于建立稳定可重复的脑梗死模型［10］。猫/狗：猫的神经系统较发达，较易建立模型，但其脑解剖结构与人脑区别较大［8］；狗的脑血管解剖结构与人体区别显著，而且具有丰富的颈内外动脉吻合系统，不利于单动脉中断法构建稳定的脑梗死灶［11］。家兔：大脑高级中枢发达程度不足，试验结果不理想［12］。啮齿类动物：包括沙土鼠和大鼠，其中大鼠经济性好、易获得与饲养，为当前模型动物首选。因基因与人类同源性高达98%，故具有相仿的血管结构，血管性损伤部位实验重复性好。并且种系内基因纯度优，同系间基因遗传稳定，已成为实验动物优选方案［13］。

1.3 模型动物影响因素 所选动物的种类、品系、性别、体质量、月龄、麻醉方法等均会对实验产生影响［14］。种类：动物种类决定且脑结构、血管生理特性不同，适合不同类型实验。动物品系：同种动物的不同品系，在实验变量完全相同时也可能产生不理想的试验结局［14］。所以应以实验需求为先选择原发性高血压动物、继发性高血压动物、老龄组动物、糖尿病动物等。性别：雌激素的分泌对脑损伤有保护作用［15］，同种条件下雄性动物梗死体积较雌性大［16］，故多选择雄性动物。体质量：个体的重量对应麻醉时及模型制备时药剂及材料的使用量大小。月龄：同种动物不同月龄时血管解剖构造具有进行性的变化［17］。以大鼠为例，选择壮年大鼠制备模型，脑梗死模型制备成功率较高，但脑缺血模型制备成功率不甚乐观；选用老年大鼠制备模型，由于管腔不同程度迂曲、硬化、狭窄，反而产生新的变量，对实验产生负面影响。麻醉方法：许多常用的麻醉剂会引起实验动物一定程度的神经保护［18］，故应加入空白麻醉组以研究实验动物的生理参数所受麻醉方法的影响。有文献提出，常见于国内实验室的戊巴比妥钠腹腔麻醉适于制作大鼠脑缺血模型，对Wistar大鼠产生极小试验误差［19］；而国外实验室则多数采用氟烷等吸入麻醉法，在缺血后7 d内动物生理参数可控率更高［20-21］。

2 传统脑缺血模型的建立

传统脑缺血模型的建立原理及方法已得到大多数实验室及研究者公认，虽然其造模方法成熟但仍囿于其局限性而仅限于特定领域。其中脑卒中患者情况以局灶性脑缺血较为符合，可采取大脑中动脉（MCA）中断构建局灶性脑缺血动物：永久性或暂时性动脉闭塞为两种主要制备方式，具体制备方法有线栓法、血栓栓塞法、开颅物理闭塞法、开颅电凝法、光化学法等。

2.1 线栓法 线栓法由学者Koizumi发明，是当前最广泛开展的局灶性脑卒中造模术式，易于实施且多数无须开颅，故具有恢复快且对生理学误差小。该法于颈部正中处切口，分离出右侧四根动脉：颈总动脉（CCA）、颈内动脉（ICA）、颈外动脉（ECA）及翼腭动脉（PPA），结扎ECA和PPA，从CCA切口插入线栓，经过ICA到达MCA起始端，结扎CCA近心端；血流再灌注研究时，由ECA放置线栓至MCA一端，移动线至ECA内，便可构建研究模型。目前研究者探究出改进型术式如下［22］：在原有基础上，不暴露PPA，阻断ICA一步通过丝线悬挂完成。具体术式为盲插入线栓至0.5 cm，向下轻压使其远端向上避开PPA开口，则线栓更顺畅地进入ICA。

2.2 血栓栓塞法 实际临床中栓子可由动脉粥样硬化、脉管炎、物理刺激等产生，沿循环系统在局部脑血管产生阻塞引起病变。学者Kudo等发明此模型建立方法［23］，其优势在于可诱发更符合实际的病理性自体栓塞，栓塞部位符合病理且缺血部位合理；而且对于栓塞的治疗—溶栓研究方面可提供极大的便利。但其也存在相应不足之处：栓块运行路径不可控和无法栓塞特定血管。鉴于导管处生成栓块后，栓块随循环系统运行路程长，故存在较大不确定性与较低可重复性，对试验产生相应误差。栓塞法制备方法可以确定栓块的来源与具体成分；但存在栓子的体积、走行路径和最后滞留位置的不确定性，栓块能否成功阻塞目标血管等问题。再者由于实验动物脑的侧支循环形成不可控的实验误差，使此方法有碍于神经疾病症状的研究和病变灶的定性定量分析。于是，在后继研究者们的努力下，例如学者沈顺姬等采取尾静脉血，制取直径0.3 mm，长4 mm栓块于显微导管中，行显微注射技术从ECA反向至ICA相汇部位，注射进ICA从而制备大鼠脑缺血模型，梗死部位恒定，可重复性好［24］。2012年学者Durand等在栓塞法基础上，于颞叶处行显微注射，导入凝血酶于MCA内，造成MCA原位血栓，再配合溶栓方案，开启血栓栓塞-溶栓这一新的研究领域［25］。

2.3 开颅物理闭塞法 由Tamura等首先建立并后继研究者不断改进［26］。本术式由颞下部或眼眶部开颅，目标血管为MCA及分支血管，阻断后可形成脑卒中灶。本术式优势为可视性高，与线栓法对比，无论术后缺血效果、术后生存时间（多达14 d或更多）与神经功能评分均优于后者［27］。另有学者采取圈套器等工具，通过对MCA的捆扎压迫与松解恢复，实现局灶性供血中断与再通。该法常用于猫及灵长类动物的研究。该术式局限性为难度偏高，术者易操作不当引起大量出血导致实验失败，并且闭塞MCA过程不可逆，因此本方法不能大量施行。后来经研究者改进方案后可行性增加，如学者金荣等选取显微夹闭法，中断一侧MCA和双侧CCA制备缺血模型并再通以研究相应溶栓药物的疗效［28-29］。学者Kaplan等采用微小金属钩压迫MCA并可再通，亦不失为另一种可行方案［29］。

2.4 开颅电凝法 该方法通过开颅手术暴露大脑中动脉，然后用电极灼烧大脑中动脉相应部位使血管闭塞，引起大脑中动脉供应区皮质及相应皮质下区域梗死。该方法具有可视性强、梗死灶形成时间短，以及梗死部位一定程度可控的优点，但因需开颅故对术者要求高，损伤大且有颅内感染风险，并且只能诱导永久性闭塞。在2013年由Yang等改进，对其左侧MCA采取电凝封闭，再中断双侧ICA血流15 min以建立模型［30］。同时多次试验表明氟烷吸入法对小鼠神经保护作用较好。该术式优势为操作快、失血少因而成功率高［31］，能够有效评价模型动物中、远期神经功能。

2.5 光化学法 由静脉，例如大鼠尾静脉导入光敏诱导剂，如常见诱导剂玫瑰红可由定波冷光源（560 nm）激发后，催化局部组织形成单氧自由基，而后者可令脂质过氧化，导致栓子形成并停留于血管内继而令血管阻塞中断［32］。由于光线透过颅骨时与血管内光敏诱导剂接触发生光化学反应，故该造模方法可令靶血管供应区产生病灶并可量化记录，同时梗死灶大小与冷光源的强度、时长和光敏诱导剂的种类、剂量相关。若需MCAO模型动物，可直接在术中显现的MCA中注射光敏诱导剂，于特定光源激发下并可在镜下观察血栓［14］。该术式易引起早期血脑屏障开放，并有可能造成较严重的微血管损害即血管源性脑水肿，此法虽有助于抗血小板和溶栓药物研究，但并不是完全模拟人体的动物模型［33］。而Yang等改进后的方案采用伊文思蓝作为光诱导剂，可见梗死区血脑屏障的破坏及神经细胞的皱缩坏死，更加有力反映局灶性脑梗死的病变进程［34］。

3 新型脑缺血模型的建立

以往的脑卒中动物模型在不同研究中逐渐显现出不足之处，因而研究者更需求高生存率、高可重复性的先进建模术式。主要制备方法有：内皮素-1诱导法；局部FeCl3化学诱导法；原位注射凝血酶；球囊导管法；皮层压迫法；CCA加压夹闭法；皮层压迫法；内膜损伤法等。还可选用转基因模型动物和基因敲除动物。

3.1 内皮素-1诱导法 内皮素-1作为较强的内源性因子可引起靶血管收缩而血流量减少，在中枢神经系统中可产生持久性的局部脑血流量减少并促进脑梗死，还可同时损伤神经元和相应区域胶质细胞造成缺血灶。学者Macrae等于MCA近端应用血管活性物质，引起相应区域血供不足并产生缺血灶，多次实验证实缺血灶大小与剂量正相关，并伴有少量的再灌注现象［35］；学者Fuxe等注射诱导剂于一侧纹状体中，可诱发卒中灶和半暗带［36］。该诱导法对以往手术方法优势在于仅有细微的机械损伤，并可通过诱导剂用量来定量影响供血中断和恢复时长［37］。由于其可令实验动物意识清醒，还可用于验证与评价神经保护剂的效果。

3.2 局部FeCl3化学诱导法 由于传统的显微操作难以制备近端血供中断模型，而且可能诱发硬脑膜及动脉周围皮质损伤，故有学者提出改进意见：利用化学诱导剂局部注射入MCA以构建模型。该术式可在动脉处产生局部血栓，具体方法为采取FeCl3等化学诱导剂局部浸润动脉内壁，在化学刺激下引起内膜剥脱与组织变性，继而诱发动脉内血栓［38］。学者刘小光等行开颅手术令特定段MCA（大脑下静脉和嗅束之间）显现于术野内，覆盖以带有FeCl3诱导剂滤纸条，操作后1 d内可形成缺血灶，病理学检查可见由混合血栓引起［39］。该方法易于显微操作，对硬脑膜和动脉周围皮质的损伤减小、死亡率低，但利用t-PA进行溶栓治疗研究时敏感性不足，不适合用于神经保护药物的研究。

3.3 原位注射凝血酶 由于传统血栓栓塞模型的血栓定位性较差，血凝块位置差异较大，并且不适宜在显微镜下操作及实时监测。近年来有学者指出可通过原位注射凝血酶诱导，从而定量确定梗死灶位置、大小，还可一定程度上提升可重复性［40］。具体可采取开颅显现MCA分支处，用微量吸管注射法致血凝块形成。该方法显微镜下可直视操作、死亡率低，并与rt-PA联动可探究溶栓药物作用［40-41］。但存在开颅手术的损伤风险及血凝块破裂诱发微小栓塞的可能。

3.4 新型改进术式 球囊导管法：作为原有线栓法的新术式，学者Hamberg等采用股动脉放置导丝，经导丝导引下球囊导管经升主动脉、CCA，最后由ICA入颅，经由控制MCA球囊大小来控制血供的中断与再通［42］。学者Jungreis等对上述方法加以创新，采取用导丝不可逆性中断MCA和用球囊可逆性中断ICA，构成脑梗死改变［43］。 CCA 加压夹闭法：学者 Nishimura 等［44］首创此法：采取沙土鼠为模型动物，于颈正中行术式，显现CCA后，利用具有弹性的聚乙烯管压迫CCA并造成物理损伤。进而具有局部血栓出现快，实验可重复性高的优点皮层压迫法：该方法采取激光多普勒探头。该术式需定位初级躯体感觉皮质，在所在骨性标志钻孔，在保证硬脑膜不受损的情况下，用带有激光多普勒探头的金属柱对硬脑膜造成物理损伤，形成局部缺血区域［45］。

3.5 内膜损伤法 分为负电流和诱导剂损伤法［41］。负电流电解损伤法：将负电极置入血管内皮，需确认电极不绝缘并紧密连接内皮细胞，采取双道方波产生器发起刺激损伤内皮细胞，形成阻塞血管腔的血栓，影响血供从而诱发卒中灶。诱导剂法：通过诱导剂刺激局部血管作用，血管内皮病理生理变化同负电流损伤法。

3.6 转基因动物和基因敲除动物的应用 转基因动物和基因敲除动物的应用，可为小鼠脑DIC时细胞损伤及神经保护机制中相关基因表达的研究引发新思路。其他造模方法也可用于该模型动物。本文中不做赘述。

4 局灶性脑缺血模型的不足与展望

以上文中介绍基本局灶性脑缺血动物的制备方法与影响因素，但由于疾病的综合性与患者状况的复杂性，通用型动物模型的建立显然不切实际，具体情况下我们作为研究者需要一种综合化立体化的考量。对于患者并发症的处理：基础实验最终是服务于临床的，而在临床诊断治疗中，往往患者伴有一种或多种并发症，作为研究者需注意此点。如高血压品系和糖尿病品系实验动物的应用可以模拟病情的复杂性，这有利于评估新型治疗方法与开发新型脑卒中药物。对于不同生理参数的处理：不同生理状况时，动物对疾病与药物的反馈具有一定差异，如血流量与体温等。研究表明皮质血流过速时易导致蛛网膜下腔出血，而温度下降对于神经外科手术的帮助也有目共睹。实验研究中不能控制的生理参数变量也会影响实验结果，而这些变量有些作为误差，有些却是未来可行的治疗机制。

目前大多数动物局灶性脑缺血模型具有局限性，只能模拟脑卒中机理的一个或数个方面，这也是本领域基础研究难以转化为临床应用的主要原因。作为研究者应选择适合研究方向的动物模型，并积极控制模型变量，及时发现模型不足并改进，力争为脑卒中的研究带来突破，为患者谋求生命质量。