查菲埃立克体致病机制研究进展

2019-01-08于学杰王缚鲲

中国人兽共患病学报 2019年8期

程琰，于学杰，王缚鲲

查菲埃立克体(Ehrlichiachaffeensis)是一种寄生于单核细胞内的革兰氏阴性菌，属于立克次体目、无形体科、埃立克体属。该病原菌于1987年首次被报道，1991年从病人血液中分离。其所致的疾病称为人单核细胞埃立克体病(Human Monocytotropic Ehrlichiosis, HME)，是一种经蜱传播的人兽共患病。人单核细胞埃立克体病在美国主要分布在中部及东南部地区，世界范围内查菲埃立克体感染的报道逐年上升[1]，分子流行病学研究证明，我国也存在人埃立克体病[2-6]。

查菲埃立克体通过细菌效应蛋白(TRP120、透明质酸酶、EtpE等)与细胞表面受体相互作用的方式粘附和入侵宿主细胞[7-10]，寄生在胞质空泡中，以膜包裹的包涵体形式生存和繁殖[11]。本文就查菲埃立克体在宿主细胞内持续生存机制的研究进展做一综述。

1 抑制宿主免疫应答

1.1细胞壁缺乏脂多糖和肽聚糖单核巨噬细胞可表达模式识别受体(pattern recognition receptors, PRRs)，如Toll样受体(Toll-like receptors, TLRS)和NOD(nucleotide-binding oligomerization domain)，这些受体可以识别和结合保守的病原相关模式分子(pathogen-associated molecular patterns)，如脂多糖和肽聚糖，启动宿主的天然免疫应答来清除入侵致病菌。然而，查菲埃立克体缺乏编码肽聚糖和脂多糖生物合成的基因[12]，因此无肽聚糖和脂多糖与模式识别受体结合，从而不能有效激活宿主的天然免疫应答。

1.2抑制或增强促炎细胞因子产生查菲埃立克体感染不能有效地诱导宿主产生IL-6、TNF-α等促炎细胞因子，从而抑制了宿主抗病原的免疫反应[13]。尽管在查菲埃立克体感染早期(48 h内)TNF-α的表达水平未增高[14]，但在感染后第5 d，TNF-α的表达水平增高近30倍。查菲埃立克体分泌的效应子Ank200(200-kDa ankyrin-repeat protein)可能通过与TNF-α基因启动子区结合诱导宿主细胞的TNF-α表达[15]。研究表明，在感染后第7天，过表达TNF-α或血清中高浓度TNF-α与HME的致死性密切相关[16]。

另有研究[17]发现，查菲埃立克体感染可降低多种细胞因子的表达，如IL-12、IL-15、IL-18等。这些细胞因子是具有多重生物学活性的促炎细胞因子，它们可激活NK细胞和辅助性T细胞产生IFN-γ，IFN-γ又可激活巨噬细胞吞噬杀伤致病菌。IL-12、IL-15也可以激活NK细胞和细胞毒性T细胞直接杀伤胞内菌寄生的宿主细胞。查菲埃立克体感染导致的IL-12、IL-15、IL-18表达水平下调，可抑制宿主的天然和获得性免疫应答，促进其持续感染。

1.3抑制IFN-γ IFN-γ具有促进抗胞内菌免疫应答的作用，其可激活NK细胞和Tc细胞直接杀伤细菌感染的宿主细胞，也能够增强巨噬细胞吞噬和处理细菌的能力，并呈递细菌抗原诱发特异性免疫应答。在查菲埃立克体感染早期，利用重组人IFN-γ处理感染细胞，IFN-γ可通过抑制宿主细胞内的转铁蛋白受体，显著降低细胞内铁含量，从而抑制病原体的生长[18]。然而，在查菲埃立克体成功感染宿主细胞后，蛋白激酶A被激活，Jak-Stat信号通路受抑，使IFN-γ表达下调和铁含量上升，从而有利于其在宿主细胞内生长[19]。研究[20]表明，查菲埃立克体的效应子TRP47(47-kDa tandem-repeat protein)可以通过与宿主细胞靶蛋白PTPN2(protein tyrosine phosphatase non-receptor type 2)相互作用，负向调节Jak-Stat信号通路去抑制IFN-γ表达。

1.4抑制Toll样受体 Toll样受体属于I型跨膜糖蛋白，胞外区具有数量各异的亮氨酸富集重复片段结构域，胞内区由与IL-1受体结构相似的信号传导结构域组成，能够识别入侵的病原体，激活细胞免疫应答，是参与宿主天然免疫的一类重要蛋白质分子，并且在特异性和非特异性免疫中发挥桥梁作用。研究[21-22]表明，TLR2/4参与的免疫应答能够促进机体对查菲埃立克体的清除。然而，在查菲埃立克体感染过程中，ERK1/2、p38 MAPK信号通路被抑制，TLR2、TLR4、CD14及相关细胞因子的表达水平降低，进而有利于其在胞内存活。

2 双组分系统调控作用

双组份系统(two-component system，TCS)是原核生物及真核生物细胞响应外界环境刺激的一种信号转导系统。细菌通过感受外界环境变化后分泌相应毒力因子来维持其自身生存，是细菌应对选择压力的一种机制。由组氨酸激酶和反应调节子组成的双组份系统，其作用机制是由外界信号分子作用于组氨酸激酶的膜外配体结合域，使组氨酸发生自我磷酸化，并将磷酸基团转移到反应调节子上，进而产生一系列的调控反应。通过序列和结构分析，查菲埃立克体基因组中具有3个组氨酸激酶(NtrY、PleC、CckA)及相应的反应调节分子(NtrX、PleD、CtrA)。有研究[23]证明，重组的查菲埃立克体NtrY、PleC、CckA具有组氨酸残基依赖的自身激酶活性，使组氨酸发生自我磷酸化，并将磷酸基团转移到相应的反应调节子上。Closantel为一种组氨酸激酶的抑制剂，体外实验表明其可抑制查菲埃立克体组氨酸激酶活性。查菲埃立克体感染宿主细胞前用Closantel进行预处理，可阻断感染；在感染宿主细胞一天后加入Closantel，可清除感染。此外，查菲埃立克体感染宿主细胞5～10 min内加入Closantel，可导致三个组氨酸激酶(NtrY、PleC、CckA)及相应的反应调节子(NtrX、PleD、CtrA)基因表达水平下调。这些结果提示，双组份系统在促进查菲埃立克体感染中发挥重要的调节作用。

3 抑制吞噬体与溶酶体的融合

吞噬体与溶酶体融合形成的吞噬溶酶体可清除胞内病原体。在吞噬溶酶体内，在多种酶的作用下通过氧依赖和氧非依赖系统杀灭和消化病原体，这是机体非特异性清除入侵病原体的免疫防御机制之一。

免疫荧光标记技术分析发现，查菲埃立克体吞噬体表面缺乏溶酶体标识分子CD63和LAMP-1(lysosomal-associated membrane protein 1)，提示吞噬体未与溶酶体融合。进一步研究发现，查菲埃立克体吞噬体表面具有早期吞噬体标识分子Rab5(Ras related protein 5)及其效应子EEA1(early endosomal antigen 1)，并可选择性地募集转铁蛋白受体[24-25]。利用芯片微阵列分析证明，查菲埃立克体感染能够抑制宿主细胞的Rab5、SNAP23(synaptosomal associated protein, 23 kDa)、STX16(syntaxin 16)等膜转运相关基因的转录，该抑制作用在感染的最初1 h内尤为显著[17]。由这些结果推测，尽管查菲埃立克体吞噬体获得了Rab5，但其抑制了吞噬体的发育成熟和与溶酶体的融合，使其获得充足时间在吞噬体内生长繁殖。然而，查菲埃立克体抑制吞噬体溶酶体融合的机制尚不清楚。

4 抑制宿主细胞凋亡

细胞凋亡是机体维持内环境稳定的一种由基因控制的自主有序的细胞死亡，也是宿主细胞杀伤胞内寄生菌的一种天然防御机制。查菲埃立克体感染宿主细胞后的最初1 h内，上游激活信号引起NF-κB抑制性配体IκB降解，激活p38MAPK通路，导致NF-κB水平上调，抑制宿主细胞凋亡。此外，查菲埃立克体诱导凋亡抑制因子IER3、BIRC3、BCL2的表达，感染早期则抑制凋亡诱导因子BIK和BNIP3L的表达，从而阻止宿主细胞凋亡，有利于埃立克体在宿主细胞内继续生存[17]。

另有研究发现，在未感染的DH82细胞中，线粒体分布于核周区域；在查菲埃立克体感染后，线粒体聚集在埃立克体包涵体周围。进一步研究发现，埃立克体感染导致线粒体代谢活性受抑，但线粒体具有膜通透性，由此推测致病菌可能通过分泌效应子与线粒体相互作用，稳定线粒体膜通透性，而另一方面，致病菌抑制线粒体代谢活性，使线粒体“休眠”，“休眠”的线粒体不能启动细胞凋亡，由此认为稳定线粒体膜通透性可能与抑制细胞凋亡相关[26]。

研究发现查菲埃立克体Ⅳ型分泌系统(T4SS)效应子ECH0825在其处于指数生长期时表达升高，抑制Bax诱导的细胞凋亡。ECH0825还可促进MnSOD(mitochondrial manganese SOD)的表达，抑制ROS(Reactive Oxygen Species)水平，并抑制ROS介导的细胞损伤和凋亡[27]。在感染的不同时期，查菲埃立克体效应子TRPs(Tandem-repeat proteins)与不同的宿主细胞蛋白相互作用，抑制细胞凋亡。TRP120(120-kDa tandem-repeat protein)与宿主细胞蛋白ICAM3(intercellular adhesion molecule 3)结合，激活Akt/ERK/CREB2途径，抑制细胞凋亡[28]。

5 逃避宿主自噬清除

细胞自噬是真核生物对胞内衰老的细胞器或损伤的蛋白质等的溶酶体降解途径，降解产物得以循环利用；同时，细胞自噬也在宿主抗病原体感染过程中发挥重要作用[29]，是机体抵抗细菌感染的第2道防线[30-32]。某些细菌(如铜绿假单胞菌、沙门氏菌)诱导的自噬能够促进机体清除入侵的细菌；而某些细菌(如布鲁氏菌)诱导的自噬则有助于其在宿主细胞内的寄生。

Niu等研究[33]发现宿主细胞内嗜吞噬细胞无形体(Anaplasma phagocytophilum)吞噬体上存在自噬标识分子MAP-LC3(microtubule associated protein 1 light chain 3)和 beclin-1。但Cheng等[34]通过质谱和免疫荧光标记分析未能在查菲埃立克体吞噬体上检测到自噬标识分子，因此推测致病菌可能通过逃避自噬对其杀伤而导致宿主持续感染。Lin等研究[35-36]发现查菲埃立克体通过Ⅳ型分泌系统分泌的效应子Etf-1(Ehrlichia translocated factor-1)与BECN1(beclin-1)、VPS34(catalytic subunit of class Ⅲphosphatidylinositol 3-kinase)、Rab5-GTP相互作用激活PtdIns3K(phosphatidylinositol 3-kinase)，诱导埃立克体自噬体形成；自噬体提供营养物质，促进致病菌生长繁殖。采用3-MA(3-Methyladenine)或spautin-1抑制自噬，或者敲除自噬相关分子ATG5(autophagy-related 5)或BECN1的编码基因后，致病菌的生长繁殖受到抑制；进一步研究发现查菲埃立克体自噬体具有ATG5、PIK3C3(phosphatidylinositol 3-kinase catalytic subunit type 3)、PtdIns3P(phosphatidylinositol 3-phosphate)和Rab5分子，但缺乏晚期自噬体标识物LAMP1和溶酶体标识物[35]，提示埃立克体自噬体与溶酶体的融合受到抑制，使其逃逸自噬溶酶体的杀伤而导致持续感染。

6 参与宿主细胞蛋白翻译后修饰

蛋白质翻译后修饰(Protein post-translational modifications, PTMs)是蛋白质在翻译后的化学修饰，是一个复杂的过程，常见的修饰类型有磷酸化、乙酰化、泛素化、SUMO化修饰(Small ubiquitin-like modifier)等。查菲埃立克体利用宿主的翻译后修饰机制促进其在胞内的生存和繁殖，其效应子能够模拟参与翻译后修饰的宿主细胞蛋白，去改变宿主蛋白和调控相应的信号通路。

磷酸化的作用位点通常为蛋白上的丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸残基，查菲埃立克体效应子TRPs具有高丝氨酸/苏氨酸含量，并且具有磷酸化位点。效应子TRP47与Src家族中的参与TCR信号通路的关键分子酪氨酸激酶Fyn结合，参与TRP47的酪氨酸磷酸化[37]。SUMO化修饰是一种重要的蛋白质翻译后修饰方式，有研究[38]证实，查菲埃立克体效应子TRP120的C末端被SUMO化修饰，用高密度微流体肽阵列技术已经确定了SUMO化位点；用小分子抑制剂抑制宿主SUMO通路，可显著降低TRP120与PCGF5(polycomb group ring finger 5)的相互作用，减少吞噬体上PCGF5聚集，从而抑制其在宿主细胞内生存[39]。查菲埃立克体分泌的效应子TRP120与泛素连接酶E3、KLHL12、FBXW7等分子作用，参与泛素化修饰而逃避宿主的免疫攻击[28]。

7 激活宿主细胞的Wnt和Notch信号通路

查菲埃立克体通过表面表达或分泌的效应子，调控宿主细胞信号通路。在其感染宿主细胞后，Jak/Stat、p38MAPK、NF-κB信号通路均被抑制，从而逃逸免疫杀伤。然而，查菲埃立克体又可通过激活Wnt和Notch信号通路，促进其胞内存活。

研究[8]证实，查菲埃立克体TRP120与Wnt5a、LRP6(lipoprotein receptor-related protein 6)、Dishevelled(Dvl)等结合，形成Wnt复合物，该复合物激活后，可以抑制下游GSK3 CK1/2蛋白复合物的形成，从而使胞质内的β-catenin稳定存在，并在胞质内聚积；β-catenin去磷酸化并移位至细胞核，与转录因子TCF/LEF作用，促进Wnt靶基因表达，从而促进其在细胞内生存。基因敲除Wnt信号通路主要分子(Wnt5a、Fzd5、β-catenin、NFAT)或与TRP相互作用的Wnt信号通路分子(ARID1B、KDM6B、IRF2BP2、PPP3R1、VPS29)，能够显著抑制查菲埃立克体感染。

Notch信号通路具有高度保守性，参与调节细胞的分化、增殖和凋亡，并在调节天然和获得性免疫应答中发挥重要作用。研究表明，查菲埃立克体效应子TRP120可以与Notch信号通路相关基因notch1[40]、非金属蛋白酶ADAM17[41]、Notch信号通路的重要调节因子NEDD4L和FBXW7[28]相互作用，激活Notch信号通路，促进其在胞内生存。