寻常型银屑病患者皮损中C/EBPβ表达水平的研究

柳莉丹，刘红芳，吉苏云，李锦意，张 娇，王晓华，陈永锋

银屑病是一种以红斑鳞屑为皮肤表现的慢性炎症免疫性疾病，伴有遗传倾向，而转录及转录后水平的研究是银屑病遗传背景研究的热点。CCAAT /增强子结合蛋白(C/EBP)是B-ZIP DNA结合蛋白家族，其作为转录因子调节许多细胞类型的生长和分化，包括肝细胞、单核细胞、脂肪细胞、角质形成细胞等[1-2]。C/EBP通过对靶基因转录的调节，广泛参与细胞增殖与分化、炎症反应、肿瘤的发生与凋亡、肝脏再生等生理过程。

在以角质形成细胞异常增殖和分化的银屑病中，C/EBPβ如何表达，是否参与了疾病的发生发展过程，目前国内外文献未有报道。为了探讨C/EBPβ与银屑病的关系，该研究检测了寻常型银屑病患者皮损以及对照组正常皮肤中C/EBPβ的分布及表达差异性，并分析C/EBPβ表达水平以及其与病情评价指标的关系。

1 材料与方法

1.1病例资料22例寻常型银屑病患者均为2016年12月～2017年5月广东省皮肤病医院皮肤科门诊患者，临床皮损和病理诊断均符合《临床皮肤病学》第二版寻常型银屑病诊断标准。排除标准：① 近3个月接受过系统治疗(如糖皮质激素、免疫抑制剂、维A酸药物等)、光化学治疗；② 合并自身免疫性疾病者；③ 影响本研究的其他皮肤疾病(如炎症性疾病、过敏性疾病、真菌感染性疾病及其他严重的慢性系统性疾病)；15例正常对照组为我院整形外科行整形手术者。两组间性别及年龄匹配。所有入选者签署知情同意书，研究通过本院医学伦理委员会审查。

1.2主要试剂和仪器TRIzol试剂(广州欣励和生物科技有限公司)；逆转录试剂盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser)；SYBR Prime Ex TaqTMⅡ均购自日本TaKaRa公司；Anti-C/EBPβ单克隆抗体(美国Abcam公司)；DAKO酶标羊抗鼠/兔IgG抗体(二抗)[基因科技(上海)有限公司]；引物合成及设计(上海生工生物工程股份有限公司)；Leica 2135石蜡病理切片机、Leica病理组织包埋机(德国Leica公司)；显微镜(日本olympus公司)；凝胶成像仪(上海天能有限公司);NanoDrop仪(美国Thermo Fisher Scientific 公司)；PCR仪(美国Bio-Rad公司)；light Cycler 480 PCR仪(瑞士Roche公司)。

1.3方法

1.3.1一般资料及标本收集 收集患者一般资料(性别、年龄、病程、皮损及临床症状等)，评估患者皮损面积和严重程度指数，即PASI评分情况。签署知情同意书后，手术室切除寻常型银屑病患者(22例)皮损组织及对照组(15例)正常皮肤组织，一半10%福尔马林液浸泡后石蜡包埋用于免疫组化，一半生理盐水冲洗后液氮冻存用于PCR检测。

1.3.2免疫组化染色法检测 取包埋后的组织修剪边缘后装入切片机作4 μm切片，烘箱过夜进行脱蜡，脱蜡后将标本进行阻断内源性过氧化物酶，PBS液冲洗后将标本架置于pH 9.0抗原修复液中进行修复(置于微波炉中中高火7 min,中底火15 min)，用自来水复温后取适量Anti-CEBPβ抗体用一抗稀释液稀释至合适浓度(稀释浓度1 ∶100)孵育标本30 min,冲洗后滴加二抗孵育20 min，最后进行DAB显色，封片后用显微镜观察C/EBPβ蛋白表达及分布(按照抗体说明书及文献，C/EBPβ阳性表现为胞核出现黄色或棕色的颗粒状物质沉积)。C/EBPβ蛋白表达水平以平均光密度值(Image pro plus 6.0软件分析图像所得)表示。

1.3.3逆转录聚合酶联反应(RT-PCR)检测 ① 提取组织中总RNA(采用经典TRIzol法，所有操作冰上进行)：取出液氮中保存的实验标本，称重后置于研钵研磨组织组织至粉末状(中途不断加入液氮)；向组织内加入适量组织裂解液TRIzol(100 mg组织/1 ml TRIzol),充分研磨混匀后将标本收集于1.5 ml无酶EP管中，冰上静置5 min；向EP管中加入0.2 ml氯仿萃取，剧烈震荡，冰上静置5 min后于4 ℃离心机进行离心(12 000 r/min、20 min)，离心后收集上层水相，并加入等体积异丙醇，小心上下混匀6次，进行RNA沉淀；再次将标本置于4 ℃离心机中，离心12 000 r/min、10 min，可见EP管底部出现白色沉淀，即为所提取组织中总RNA；除去上清液，加入预冷的75%乙醇进行沉淀清洗，小心上下混匀，防止RNA降解；清洗后去除液体于超净工作台进行风干，最后加入20 μl DEPC水进行RNA溶解，其后用NanoDrop仪检测RNA浓度，按照逆转录试剂盒将RNA逆转为cDNA,置于-80 ℃冰箱保存或用于实时荧光定量PCR实验；② 进行实时荧光定量PCR：以GAPDH作为内参，C/EBPβ上游引物：5’-TCTCTGCTTCTCCCTCTGCC-3’，下游引物：5’-ACAGCAACAAGCCCGTAGG-3’ ；GAPDH上游引物：5’-AAGTATGACAACAGCCTCAAG-3’，下游引物：5’- TCCACGATACCAAAGTTGTC-3’；采用20 μl反应体系，在PCR板中分别加入10 μl SYBR Premix Ex Taq、2 μl cDNA 、6.4 μl无RNase水、上下游引物各0.8 μl，实时荧光定量PCR仪上机检测，软件读取C/EBPβ及GAPDH的Ct值；对数据进行相对定量分析，利用所测Ct值，计算C/EBPβ mRNA相对表达量，本实验中采用2-ΔΔCt相对定量方法对数据进行分析，其中ΔΔCt=ΔCt实验组-ΔCt对照组。

1.3.4相关性分析 按照银屑病皮损面积及严重程度指数(psoriasis area and severity index，PASI)评分标准，记录患者PASI评分，并进行Pearson相关性分析，评估皮损组织中C/EBPβ平均光密度与PASI评分相关性。

2 结果

2.1实验对象基本资料分析22例寻常型银屑病患者中，男13例，女9例；年龄17～78(40.95±16.609)岁；病程3个月～30年，平均(7.7±7.438)年；PASI评分为2.4～18.8分。15例正常对照组，男7例，女8例；年龄19～58(31.33±11.848)岁 。寻常型银屑病患者与正常对照者在性别(χ2=0.734，P>0.05)、年龄构成上差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2寻常型银屑病患者与对照组组织中CEBPβ表达及分布免疫组化染色法定位CEBPβ在寻常型银屑病皮损中广泛分布于表皮各层细胞胞核，以棘层上部及颗粒层为主，正常对照组则可见CEBPβ强烈表达于表皮各层细胞的胞核(图1)；CEBPβ平均光密度值(0.204±0.582)低于对照组(0.273±0.439)，差异具有统计学意义(t=-3.894,P<0.001)。见图2。

2.3寻常型银屑病与正常对照组组织中CEBPβmRNA表达量RT-PCR方法检测组织中CEBPβ mRNA表达量，结果表明：寻常型银屑病患者CEBPβ mRNA(0.48±0.302)表达量低于正常对照组(0.754±0.194)，差异具有统计学意义(t=-3.11，P<0.005)。见图3。

2.4组织中CEBPβ表达量与患者PASI评分相关性分析22例寻常型银屑病患者PASI评分为(4.196±0.895)，相关性分析显示组织中CEBPβ 蛋白的表达与患者PASI评分呈负相关性(r=-0.642,P<0.005)。见图4。

图1 银屑病组与正常对照组中C/EBP β表达

图2 银屑病组患者与正常对照组组织中CEBPβ平均光密度值

图3 银屑病组患者与正常对照组组织中CEBP β mRNA表达量

3 讨论

银屑病是一种多基因参与的红斑鳞屑性皮肤病，通过免疫介导的共同通路最后引起角质形成细胞发生增殖的慢性炎症免疫性疾病。CCAAT增强子结合蛋白(C/EBP)是在肝脏、脂肪组织、血液细胞和内分泌胰腺分化过程中选择性表达的碱性区域/亮氨酸拉链(bZIP)转录因子[3]，包括6个家族成员，其中C/EBPβ可参与调控炎性细胞因子IL-α、IL-1β、IL-6、IL-17、IL-36α和INF-γ等的表达[4-6]，而这些细胞因子在银屑病炎症反应中起到重要作用。

图4 银屑病皮损中C/EBPβ平均光密度值

C/EBPβ也称作核因子白细胞介素-6(nuclear factor for IL-6，NF-IL6)，由于该基因mRNA有4个转录起始点，故该蛋白包括LAP*、LAP和LIP三种主要亚型，其中LAP*、LAP为转录激活因子，而LIP为转录抑制因子[7]。C/EBPβ在小鼠和人表皮中高度表达在1997年已被提及，House et al[8]发现C/EBPβ丰富的表达于小鼠皮肤、毛囊及皮脂腺中，主要表达在基底层上部的三种角质形成细胞的细胞核内，且比已知表达高水平C/EBP的其他组织中观察到的水平更高。Zhu et al[9]研究发现在C/EBPβ缺乏的原代角质形成细胞中，早期分化标志角蛋白K1和K10的表达明显增加，表皮是由角质形成细胞构成的复层鳞状上皮，表明该转录因子在复层鳞状分化中可能起作用[8]。Oh et al[10]在皮肤癌研究中发现C/EBPβ可参与诱导p53的表达和细胞凋亡，同时Zhu et al[11]在小鼠试验中，证实C/EBPβ是化学诱导的皮肤乳头状瘤形成所必需的。

本研究显示正常皮肤组织中C/EBPβ均一表达于表皮全层细胞胞核，而银屑病皮损中C/EBPβ则主要表达在分化的上皮层，表皮分化过程中需要基因参与调控，推测C/EBPβ可能具有参与调控银屑病表皮异常分化的能力。免疫组化显示银屑病组C/EBPβ的蛋白表达水平低于正常对照组，同时RT-PCR亦发现银屑病皮损中mRNA的表达量与皮损中蛋白表达一致，结合C/EBPβ蛋白在银屑病及正常对照组均表达于细胞核，以上均提示C/EBPβ可能是在转录水平发挥其调控作用。本研究与既往实验[12- 13]均表明正常表达水平的C/EBPβ是表皮角质形成细胞分化所必须的，其表达水平的下调可能参与了银屑病角质形成细胞的异常分化，但具体机制仍需进一步验证。C/EBPβ mRNA及蛋白水平变化均提示在银屑病表皮的增殖和分化中其可能发挥抑制作用，这可能与C/EBPβ的亚型LIP发挥转录抑制作用相关。为进一步研究C/EBPβ与银屑病的相关性,本研究分析了组织中C/EBPβ蛋白的表达与银屑病皮损面积和严重程度指数(PASI评分)的相关性，结果显示其表达与PASI评分呈负相关性，进一步说明了C/EBPβ可能参与银屑病皮损中角质形成细胞异常增殖的过程，可作为一种反映银屑病皮损严重程度的指标。

综上所述，本实验初步证实了C/EBPβ与银屑病发病存在相关性，为后续研究提供了提供了新的实验基础和研究方向。然而C/EBPβ在银屑病中是否通过调控细胞因子或者炎症信号通路进而发挥调控作用仍需进一步的研究。