miR-362-5p在胃癌中的表达及对胃癌细胞增殖和迁移的影响

魏小丽，Ahmed Yaser，赵奇红，王 华，顾康生

胃癌是世界上主要的恶性肿瘤之一[1]。胃癌患者5年总生存率仍然很低[2]。胃癌的发病与环境、基因等因素有关[3]，但其发病机制仍需阐明。大量研究[4-5]证实miRNAs(microRNAs)参与多种癌症进程。miR-362-5p已被报道参与肝癌[6]、乳腺癌[7]发展。然而，miR-362-5p在胃癌中的生物学作用尚不清楚。为此，该课题通过茎环Real time PCR(RT-PCR)法检测miR-362-5p在35例胃癌患者术后癌组织中与相应癌旁组织中的表达差异情况，并分析这种表达差异与临床病理参数的相关性；同时也分析了miR-362-5p在胃癌细胞系SGC7901、AGS中与胃黏膜细胞系GES-1中的表达差异情况，以此通过重组慢病毒转染法研究过表达、敲低miR-362-5p对人胃癌细胞及胃黏膜细胞的增殖、迁移能力的影响，为阐明胃癌发生及转移等机制提供基础。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1病例资料 选取2015年在安徽医科大学第一附属医院胃肠外科手术治疗的胃癌患者35例，年龄35～74(56.3±8.9)岁，均经术后组织病理检查明确诊断。所有患者临床资料完整，术前未接受任何抗肿瘤治疗，并排除远处转移。本研究经医院伦理委员会批准，患者均知情同意。

1.1.2实验材料 临床标本收集使用的RNA later溶液购自美国Thermo Fisher公司；总RNA提取试剂TRIzol购自美国Invitrogen公司；miRNA逆转录试剂盒、RT-PCR试剂以及敲低、过表达慢病毒载体均购自上海吉玛制药技术公司；人胃癌细胞系SGC7901、AGS及人胃黏膜上皮细胞GES-1购自中国科学院上海生命科学院细胞资源中心；RPMI-1640培养基、胎牛血清、双抗(青霉素和链霉素)、胰酶购自美国Gibco公司；MTT、DMSO购自美国sigma公司；DEPC水购自上海生工生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1组织RNA提取 所有组织在离体15 min内被置于RNA later溶液中保存，再置于液氮中保存待用。取组织50～100 mg，加1 ml TRIzol，加入DECP水浸泡的磁珠；匀浆至肉眼不可见块状物，吸铁石吸出磁珠；4 ℃离心后，收集上清液至无酶EP管中加氯仿0.2 ml，剧烈震摇15 s，室温静置5 min；离心收集上清液加异丙醇0.5 ml，反复摇匀，室温静置20 min；离心见RNA沉淀，弃上清液，加75%乙醇1 ml，轻弹管壁，使RNA浮起，重复一次；4 ℃离心后弃上清液，自然干燥5～10 min至RNA变透明；加适量DECP水，稀释定量。

1.2.2细胞培养 在RPIM-1640培养基中加入终浓度10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素，制成完全培养基。用配好的完全培养基培养细胞，将细胞置于5% CO2、37 ℃的培养箱中孵育。细胞生长到汇合度80%时弃去原有培养基，PBS冲洗，胰酶消化、传代、种板。当细胞处于对数生长期时，将培养基更换至无血清的培养基，来进行后续实验。

1.2.3细胞RNA提取 取大皿细胞汇合度90%左右，用冷PBS清洗2遍，加1 ml TRIzol吹打至液体澄清，静置5 min，将裂解液移至无酶EP管中加氯仿0.2 ml，剧烈震摇15 s，室温静置5 min；离心收集上清液加异丙醇，摇匀，静置，离心见RNA沉淀，弃上清液，加乙醇清洗2次，自然干燥至RNA变透明，加适量DECP水，稀释定量。

1.2.4RT-PCR 使用Nanodrop 2 000仪器检测总RNA浓度及纯度，记录每个样品的浓度，吸光值(absorbance，A)A260/A280的值处于1.8～2.0间，代表RNA纯度良好，最后用DEPC水将各组样品提取的RNA稀释定量。以U6为内参，根据miRNA逆转录试剂盒(Hairpin-itTMmicroRNAs and U6 snRNA Normalization qRT-PCR Quantitation Kit)说明书合成cDNA第一链后，在LightCycler 96系统(Roche)上进行PCR扩增，记录Ct值，检测miRNA的表达。miRNA的相对表达量用2-ΔCt表示。ΔCt为同一样本中目的基因与内参基因(U6)Ct 值之差，即ΔCt=CtmiR-362-5p-CtU6；ΔΔCt =ΔCt癌组织-ΔCt癌旁组织或ΔCt胃癌细胞-ΔCt胃黏膜细胞。

1.2.5重组慢病毒转染 将对数生长期的细胞种于12孔板中，当细胞汇合度30%～50%时，吸去旧培养基，换成不含血清及双抗的培养基，将构建好的敲低或过表达miR-362-5p慢病毒载体(含有目的片段、GFP荧光标记、抗嘌呤霉素耐药基因)，加入培养孔中。24 h后，吸去孔中含有慢病毒的培养基，加入新鲜完全培养基进行细胞培养。72 h后，在荧光显微镜下观察荧光蛋白GFP的表达，评估转染效率。利用嘌呤霉素筛选转染的细胞以获得纯种的转染细胞，RT-PCR法验证细胞目的基因过表达或敲低的效率；培养、传代、保种，进行后续实验。

1.2.6MTT法检测细胞增殖能力 将处于对数生长期的SGC7901、AGS、GES-1各组细胞制成单细胞悬液并计数，使细胞数约为5×103/L，接种于96孔板中，每孔200 μl细胞悬液；放置在5% CO2、37 ℃的培养箱中，分别培养0(贴壁后，约4 h)、1、2、3、4、5、6、7 d；每2 d更换培养液；结束培养前4 h，向每孔中加入20 μl的MTT溶液(浓度为5 g/L)，置于培养箱中继续培养4 h；培养结束后，吸出上清液，向每孔中再加入150 μl DMSO，避光条件下，水平震动10 min；最后在酶标仪上检测各组细胞在490 nm处的OD值，绘出细胞增殖曲线。

1.2.7划痕实验检测细胞迁移 将处于对数生长期的SGC7901、AGS、GES-1各组细胞制成单细胞悬液并计数，接种细胞于6孔板中，置5% CO2、37 ℃的培养箱中，待细胞贴壁生长汇合度约为80%时，吸取旧液，每孔用枪头沿着灭菌后的直尺划出横竖各两道线，用PBS液将划掉的脱落细胞洗去，换成无血清的RPIM-1640培养，分别在显微镜下观察拍摄0 h(即细胞划痕的初始状态)、24 h各组细胞的状态。利用Image-pro plus 6.0软件计算划痕宽度，计算细胞24 h迁移距离。迁移距离(μm)=划痕宽度0 h(μm)-划痕宽度24 h(μm)。

2 结果

2.1miR-362-5p在胃癌组织及胃癌细胞中表达较高RT-PCR法分析miR-362-5p在35例胃癌组织中与其相应癌旁组织的表达量，结果显示：miR-362-5p在胃癌组织的表达明显高于其相应的癌旁组织，差异有统计学意义(t=5.611，P<0.001，图1A)。并且PCR结果也显示，miR-362-5p在胃癌细胞系SGC7901、AGS的表达量均高于胃黏膜细胞GES-1，差异有统计学意义(t=11.28，P<0.01；t=7.96，P<0.05，图1B)。

2.2相对于癌旁组织，胃癌组织miR-362-5p的表达量与临床病理参数的关系35例胃癌患者中，TNM分期较晚、分化程度较低、有淋巴结转移的肿瘤中miR-362-5p表达量要高于TNM分期较早、分化程度较高、无淋巴结转移的肿瘤中。见表1。

表1 胃癌组织miR-362-5p的相对表达

2.3稳定细胞系的建立在人胃癌细胞SGC7901、AGS中，转染敲低miR-362-5p表达的慢病毒载体；而在人胃黏膜细胞GES-1中，转染过表达miR-362-5p表达的慢病毒载体。通过RT-PCR验证过表达或敲低效率。结果显示：miR-362-5p在miR-362-5p-inhibitor载体转染的SGC7901、AGS细胞中的表达水平分别低于miR-362-5p-control载体转染的SGC7901、AGS细胞，差异有统计学意义(t=-23.9，P<0.01；t=-10.5，P<0.01；图2A)。在miR-362-5p-mimics载体转染的GES-1细胞中miR-362-5p的表达水平明显高于miR-362-5p-control载体转染的GES-1细胞，差异有统计学意义(t=3.5，P<0.05，图2B)。以上结果提示miR-362-5p过表达、敲低的成功。

图1 miR-362-5p在胃癌组织及胃癌细胞中的表达

A：miR-362-5p在35例胃癌组织中(相对于相应的癌旁组织)的表达水平；与癌旁组织比较：***P<0.001；B：miR-362-5p在胃癌细胞SGC7901、AGS中的相对表达水平；与胃黏膜细胞GES-1比较：*P<0.05，**P<0.01

2.4miR-362-5p促进细胞迁移在SGC7901、AGS细胞中敲低miR-362-5p的表达，在GES-1细胞中过表达miR-362-5p，利用划痕实验分别检测各组细胞的迁移能力，结果显示(图3)：在SGC7901胃癌细胞24 h迁移距离中，miR-362-5p-inhibitor组为(18±4.60)μm,显著低于miR-362-5p-control组的(44.82±3.71)μm，差异有统计学意义(P<0.05)；在AGS胃癌细胞24 h迁移距离中，miR-362-5p-inhibitor组为(12.56±3.06)μm,也明显低于miR-362-5p-control组的(38.77±4.06)μm，差异有统计学意义(P<0.05)；而在GES-1胃黏膜细胞24 h迁移距离中，miR-362-5p-mimics组为(30.23±3.65)μm,高于miR-362-5p-control组的(16.89±2.37)μm，差异有统计学意义(P<0.05)。因此，在人胃癌细胞SGC7901、AGS中敲低miR-362-5p表达后，胃癌细胞的迁移能力显著下降；而在人胃黏膜细胞GES-1中过表达miR-362-5p后，胃黏膜细胞的迁移能力增强。结果提示miR-362-5p促进胃癌细胞迁移。

图2 细胞中miR-362-5p敲低、过表达的验证

A：SGC7901、AGS细胞转染miR-362-5p-inhibitor载体与转染miR-362-5p-control载体后miR-362-5p表达水平的变化；B：GES-1细胞转染miR-362-5p-mimics载体与转染miR-362-5p-control载体后miR-362-5p表达水平的变化；与miR-362-5p-control组比较：*P<0.05，**P<0.01

图3 miR-362-5p对细胞迁移能力的影响 ×100

2.5miR-362-5p促进细胞增殖利用MTT法检测细胞增殖能力，结果显示：在人胃癌细胞SGC7901、AGS中敲低miR-362-5p表达后，胃癌细胞的增殖能力显著下降，差异有统计学意义(P<0.05，图4A、4B)；而在人胃黏膜细胞GES-1中过表达miR-362-5p后，胃黏膜细胞的增殖能力增强，差异有统计学意义(P<0.05，图4C)。结果表明miR-362-5p促进胃癌细胞增殖。

3 讨论

胃癌居世界癌症死亡率的第3位。较低的诊断和高复发是影响胃癌患者预后的主要障碍[8]。正常情况下，胃黏膜细胞的代谢、增殖保持在动态平衡内，而维持这种平衡依赖抑癌基因、癌基因及其靶基因的共同调控。由于胃癌早期缺乏特异性临床症状或无任何症状，易被漏诊或误诊。因此寻找敏感、特异的分子生物学标志物成为当下研究热点。

miRNAs是一种长度为19～24个核苷酸的非编码单链小分子RNA，通过碱基互补配对与靶基因mRNA的3’-UTR进行碱基配对，调节转录及转录后水平的基因表达，从而导致转录抑制或mRNA的降解[9-10]。miRNA调控的靶基因可以是抑癌基因或癌基因，亦或者是细胞周期进程、分化或凋亡基因[11]，因此异常表达的miRNA便通过异常的正向或反向调控基因表达，来直接调控细胞增殖、分化等，并参与肿瘤的发生发展甚至侵袭转移。研究表明，多种功能miRNA分子在肿瘤中异常表达，包括胃癌[12]、肾癌[13]、甲状腺癌[14]等。Ni et al[6]发现miR-362-5p在肝癌组织中明显较癌旁组织高表达，并且靶向调控CYLD表达，从而激活NF-κB信号通路，最终促进肝癌细胞生长和转移。Ni et al[7]也证实了miR-362-5p的上调显著加速了人类乳腺癌MCF7细胞的进展。此外，已有研究证实miR-362-5p是长链非编码RNA CASC2内生靶点，miR-362-5p能激活NF-κB通路，CASC2通过靶向miR-362-5p，抑制NF-κB通路，从而抑制肝癌进展。

图4miR-362-5p对细胞增殖能力的影响

A、B：SGC7901、AGS细胞分别转染miR-362-5p-inhibitor载体与miR-362-5p-control载体后细胞增殖能力的变化；C：GES-1细胞中转染miR-362-5p-mimics载体与miR-362-5p-control载体后细胞增殖能力的变化 ；与miR-362-5p-control组比较：*P<0.05

关于miR-362-5p在胃癌中的表达及对胃癌细胞增殖和迁移的影响，相关文献报道较少。本研究结果显示miR-362-5p在胃癌组织的表达明显高于其相应的癌旁组织；且miR-362-5p在胃癌细胞系SGC7901、AGS的表达量均高于胃黏膜细胞GES-1；表明miR-362-5p可能在胃癌的发生过程中发挥着癌基因角色。miR-362-5p在TNM分期较晚、分化程度较低、有淋巴结转移的肿瘤中的表达量要高于TNM分期较早、分化程度较高、无淋巴结转移的肿瘤，表明肿瘤增殖、浸润和肿瘤转移能力越强，miR-362-5p表达量越高。而miR-362-5p在肿瘤中的相对表达量，与患者的年龄、性别均无关。通过重组慢病毒载体转染，成功构建了稳定过表达、敲低miR-362-5p的细胞系。进一步的实验数据显示，在胃癌细胞SGC7901、AGS中敲低miR-362-5p表达后，细胞的增殖、迁移能力显著下降；在胃黏膜细胞GES-1中上调miR-362-5p表达后，细胞的增殖、迁移能力明显增强。因此，miR-362-5p在胃癌发展中发挥癌基因的角色，促进胃癌细胞的增殖、迁移。miR-362-5p有望成为胃癌诊断的分子生物学标志物之一。由于miRNAs作用途径的多样性，后期将研究miR-362-5p在胃癌中是通过调控何种信号通路及靶基因来发挥促癌作用，从而进一步阐明其在胃癌中的生物学功能及机制。