紫花苜蓿内生和非内生细菌遗传多样性及其分泌IAA和溶磷能力

2019-01-07康文娟姜哲浩师尚礼

草原与草坪 2018年6期

康文娟，姜哲浩，师尚礼

(甘肃农业大学草业学院/草业生态系统教育部重点实验室/甘肃省草业工程实验室/中-美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃兰州 730070)

与植物相关的细菌大多存在于土壤、植物根际、表面或组织内。定殖在植物内部组织并不对植物造成伤害的一类细菌称为内生细菌(Endophytic bacteria)[1-2]。内生细菌定殖性强，不易受外界环境影响，能够促进植物生长[3-4]，增强植株的生物和非生物[5-6]抗性，产生植物生长促进激素IAA和溶解磷元素[7]，对宿主植物有稳定、直接而有益的影响。内生细菌几乎在已研究的所有植物中都有发现，分离自豆科植物根瘤的内生细菌已超过129个种(54个属)，其中Bacillus，Pseudomonas，Paenibacillus，Agrobacterium，Enterubacterium是优势属[8]。有关内生细菌的多样性[9]、生防效果[10]和促生能力[11]方面的研究已有很多报道。与内生细菌相对，存在于根际和土壤的细菌称为非内生细菌(Non-endophytic bacteria)。

紫花苜蓿(Medicagosativa)是重要的豆科牧草，其环境适应能力强，粗蛋白含量丰富。紫花苜蓿内生细菌能够不同程度地拮抗多种病原真菌，抑制尖孢镰刀对紫花苜蓿造成的萎蔫作用，具有较强的生防效果[12-13]；有些内生细菌能够产嗜铁素、HCN、几丁质酶和羧甲基纤维素酶等[14]；部分紫花苜蓿内生细菌和根际细菌也因其促生能力在生产中得到广泛应用[15]。根瘤菌是有益的土壤细菌，能够在土壤中与苜蓿共生结瘤固氮，也能够在植物组织内定殖[16-18]。已有大量内生根瘤菌分离自紫花苜蓿的种子[19-20]、花、叶、茎和根[21-22]。

目前，对紫花苜蓿内生细菌(来自根瘤、种子、根、茎、叶和花等)和非内生细菌(来自土壤)种群的遗传多样性进行综合研究较少。通过分离和鉴定甘肃省3个不同栽培区域5个紫花苜蓿品种的内生和非内生细菌，并对其遗传多样性和促生能力进行研究，旨在从整体水平上阐明内生和非内生细菌种群之间的联系和多样性差异。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验地概况 2014年5月和8月，分别在甘肃省武威市凉州区黄羊镇牧草试验站、白银市会宁县会师镇牧草试验基地和甘肃农业大学兰州牧草试验站进行采样。样地基本概况见表1。

1.1.2 苜蓿品种 5个供试紫花苜蓿品种均已生长2年，分别为国内选育品种甘农3号(M.sativacv.Gannong No.3)和甘农9号(M.sativacv.Gannong No.9)、地方品种陇中(M.sativacv.Longzhong)和清水(M.sativacv.Qingshui)、引进美国品种WL168HQ(M.sativacv.WL168HQ)(表1)。

1.1.3 培养基和营养液菌株培养采用YMA培养基，活化采用TY培养基。

1.2 试验方法

1.2.1 样品采集于2014年5月(初花期)在各样地随机采集5份植株、根际土壤和田间土壤，8月(成熟期)田间收集种子，并清选。分别装于自封袋，标记，冰桶冷藏条件下带回实验室。

1.2.2 菌株分离及纯化用无菌剪刀将植株分为花、茎、叶、根瘤、根表皮和根中柱，将种子及以上组织分别置于50 mL无菌三角瓶，用0.45%～0.55%(w/v)碘伏灭菌3 min，无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干表面明水后研磨至匀浆；制备根际土壤和田间土壤悬浮液；采用稀释涂抹法分别分离组织研磨匀浆中的内生细菌和土壤悬浮液中的非内生细菌。每个处理4个重复。分离和纯化后的菌株于YMA培养基4℃保存。操作参考Miao[23]的方法。

表1 菌株和样地概况Table 1 Details of bacteria and sampling sites

1.2.3 细菌DNA提取和PCR扩增用上海生工生物工程有限公司细菌DNA提取试剂盒(SK8256)提取内生菌基因组DNA，方法参见试剂盒说明书。采用引物P1 (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACG AAC GCT-3′)和P6 (5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3′)[24]、nodC540 (5′-TGATYGAYA TGGARTAYTGGYT-3′)和nodC1160 (5′-CGYGACARCCARTCGCTRTTG-3′)[25]、nifHF(5′-TAC GGNAARGGSGGNATCGGCAA-3′)和nifHR(5′-AGCATGTCYTCSAGYTCNTCCA-3′)[26]分别对细菌的16S rRNA、nodC和nifH基因片段进行PCR扩增。所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成。25 μLPCR扩增反应体系为13 μL 2 ×TaqMaster Mix,1 μL上游和下游引物,2 μL纯化的DNA,8 μL ddH2O。16S rRNA基因PCR扩增反应条件为95℃预变性5 min，30个循环的94℃变性30 Sec，58℃退火1 min，72℃延伸2 min，以及72℃终延伸10 min[24]。结瘤基因nodC扩增反应条件为95℃预变性5 min，30个循环的94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，以及72℃终延伸5 min[25]。固氮基因nifH扩增反应条件为95℃预变性5 min，30个循环的94℃变性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸1 min，以及72℃终延伸5 min[26]。1.5%琼脂糖凝胶(TAE) 100 V电泳30 min，UV检测16S rRNA基因PCR扩增产物片段大小和产量；PCR扩增产物于-20℃保存。

1.2.4 16S rRNA基因PCR-RFLP 选用4种限制性内切酶HinfⅠ、AluⅠ、HaeⅢ和MspⅠ对16S rRNA基因PCR扩增产物进行酶切[27]。酶切反应体系为3 μL 16S rRNA基因PCR扩增产物，5 U内切酶，1 μL缓冲液，ddH2O补足至10 μL，于37℃水浴酶切反应12 h。3%琼脂糖凝胶(TAE) 200 V电泳40 min，UV检测酶切结果，TIFF格式保存。

1.2.5 序列测定分析供试菌株PCR扩增产物委托上海生工生物有限公司进行测序。通过EzBioCloud鉴定服务网站 ( https://www.ezbiocloud.net/)[28]获得与目的序列同源性最高的模式菌株16S rRNA序列；通过NCBI数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly)选择与目的序列同源性最高的模式菌株nodC和nifH序列。用MEGA 6.0软件中的ClustalW进行序列相似性比对[29]，选用Neighbor-joining法进行UPGMA分析生成系统发育树，Bootstrap法(1 000次重复)检验发育树。

1.2.6 菌株溶磷和分泌IAA能力测定采用有机磷蛋黄卵磷脂EYPC和无机磷Ca3(PO4)2固体培养基溶磷圈法测定菌株溶磷能力[30]，28℃培养7 d后测定根瘤菌菌落溶磷透明圈直径与菌落直径的比值(D/d)。参照文献[31]的方法分析菌株分泌IAA的能力。

1.3 数据分析

采用Excel2010制表；Shannon-Weiner多样性指数计算参考柯春亮的方法[32]。用SPSS 19.0进行统计分析，用平均值和标准误表示测定结果，分别对不同菌株D/d值进行单因素方差分析，并用Duncan法对数据进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 分离的菌株

从甘肃省3个地理区域的5个紫花苜蓿品种不同部位分离到103株细菌(表1)。73株内生细菌分别分离自根瘤(41)、根表皮(18)、根中柱(9)、茎(2)、花(2)和种子(1)，30株非内生根瘤菌来自田间土壤(19)和根际土壤(11)。叶片中没有分离到内生细菌。

2.2 16S rRNA基因PCR-RFLP

为了阐明103株细菌的系统发育关系和分类地位，用4种限制性内切酶对菌株16S rRNA扩增产物进行酶切，得出16S rRNA RFLP分型组合(表2,3)。103株纯化的菌株经4种内切酶反应共产生34种酶切组合。内生细菌中共产生27种酶切组合，非内生细菌中共产生16种酶切组合。Enisifermeliloti种内有7个酶切类型，Rhizobiumradiobacter种内有12个酶切类型，其余所有细菌种内均仅存在1个酶切组合。

2.3 根瘤菌16S rRNA测序分析

根据16S rRNA基因PCR-RFLP分析结果(表2，3)，选择34个代表菌株(R-strains)进行16S rRNA基因部分序列测定。结果表明，34株代表菌株属于15个属，根据16S rRNA基因核酸序列相似性，所有菌株都可以被划分为特定的种(图1)。其中3个属的菌株属于根瘤菌：Rhizobiumradiobacter(与ATCC 19358T序列97%～98%相似，12个酶切类型，20株)、R.hizobiumrosettiformans(与W3T序列100%相似，1个酶切类型，1株)、Ensifermeliloti(与LMG 6133T序列99%～100%相似，7个酶切类型，32株)和Phyllobacteriumcatacumbae(与CSC19T序列98%相似，1个酶切类型，2株)；12个属的菌株属于非根瘤菌：Sphingomonaskyeonggiensis(与THG-DT81T序列97%相似，1个酶切类型，1株)、Lysinibacillusfusiformis(与NBRC 15717T序列99%～100%相似，1个酶切类型，15株)、Bacillustoyonensis(与BCT-7112T序列99%相似，1个酶切类型，2株)、Psychrobacillussoli(与NHI-2TT序列97%相似，1个酶切类型，7株)、Exiguobacteriummexicanum(与8NT序列97%相似性，1个酶切类型，1株)、Variovoraxparadoxus(与NBRC 15149T序列99%相似，1个酶切类型，1株)、Pseudomonassimiae(与OLiT序列99%相似，1个酶切类型，2株)、P.granadensis(与F-278770T序列99%相似，1个酶切类型，5株)、Acinetobacterpittii(与CIP 70.29T序列100%相似，1个酶切类型，1株)、Erwiniagerundensis(与EM595T序列99%相似，1个酶切类型，2株)、Enterobacterasburiae(与JCM 6051T序列99%相似，1个酶切类型，1株)、Leclerciaadecarboxylata(与NBRC 102595T序列98%相似，1个酶切类型，2株)和Enterobacterludwigii(与EN-119T序列99%相似，1个酶切类型，8株)。

表2 代表菌株16S rRNA PCR-RFLP和不同种在栽培区域和苜蓿品种的分布Table 2 RFLP analysis of PCR-amplified 16S rRNA and distribution of different species of representative strains in cultural region and alfalfa varieties

注：a 基于16S rRNA基因系统发育树的种名；b字母组合(A-J,a-z) 代表由4种内切酶AluⅠ,HaeⅢ,HinfⅠ 和MspⅠ反应产生的16S rRNA RFLP基因型

表3 代表菌株不同种在各部位组织的分布Table 3 Distribution of different species of representative strains in plant tissues

注：a 基于16S rRNA基因系统发育树的种名；b 种内16S rRNA RFLP条带类型

图1 代表菌株16S rRNA基因序列系统发育树Figure 1 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences of representative isolates

2.4 细菌在栽培区域、苜蓿品种和组织部位的分布

2.4.1 细菌种内不同酶切类型的分布细菌种内16S rRNA PCR-RFLP类型在不同区域、苜蓿品种和部位组织的分布表示菌株遗传变异程度(表2，3)。E.meliloti种内存在7个酶切类型，EM1(24)丰度最高，在3个栽培区域、5个苜蓿品种以及根瘤、表皮、中柱和田间土壤均有分布。EM2～EM7中除EM4代表3个菌株并分布在武威甘农9号苜蓿根瘤外，其余5个酶切类型仅代表1个菌株，如EM2，EM6和EM7分布于武威甘农3号根瘤，EM3和EM5分别分布于会宁陇中苜蓿根表皮和根瘤。R.radiobacter种内存在12个酶切类型，RR6(5)和RR9(5)丰度最高，前者分布在武威甘农9号田间土壤和会宁陇中苜蓿根表皮，后者分布于兰州WL168HQ苜蓿的根瘤、中柱和茎。其余10种酶切类型仅代表1个菌株并具有分布部位专一性，如RR1、RR2、RR3、RR4和RR5分别分布于武威甘农3号苜蓿的中柱、中柱、根瘤、根表皮和根际土壤，RR7和RR8均存在于会宁陇中苜蓿的根际土壤，RR10、RR11和RR12分别分布于兰州WL168HQ苜蓿根瘤、种子和田间土壤。

2.4.2 细菌不同种的分布除E.meliloti和R.radiobacter以外的所有细菌种内均仅存在1种酶切组合，每个酶切组合代表1种细菌(15种)。其中根瘤菌有2个种：R.rosettiformans(兰州WL168HQ苜蓿田间土壤)和P.catacumbae(会宁陇中苜蓿根瘤和清水苜蓿根表皮)；非根瘤菌有13个种：E.ludwigii(武威甘农3号苜蓿根表皮、根中柱、田间土壤以及兰州WL168HQ苜蓿田间土壤)、V.paradoxus(武威甘农3号苜蓿根中柱)、P.soli(武威甘农9号苜蓿根中柱、会宁陇中苜蓿根表皮和清水苜蓿根瘤、根表皮和田间土壤)、B.toyonensis(武威甘农9号苜蓿根瘤)、L.adecarboxylata(武威甘农9号苜蓿根表皮和田间土壤)、L.fusiformis(武威甘农9号苜蓿根表皮、根中柱和根际土壤、会宁陇中苜蓿根瘤、根表皮、根际土壤和花、清水苜蓿根瘤和根际土壤以及兰州WL168HQ苜蓿根表皮和根际土壤)、P.granadensis(武威甘农3号田间土壤和甘农9号苜蓿根际土壤以及兰州WL168HQ苜蓿根瘤、茎和田间土壤)、P.simiae(会宁清水苜蓿根表皮和兰州WL168HQ苜蓿根际土壤)、E.gerundensis(会宁清水苜蓿花和田间土壤)、A.pittii(武威甘农3号苜蓿根瘤)、E.asburiae(兰州WL168HQ苜蓿田间土壤)、E.mexicanum和S.kyeonggiensis(会宁陇中苜蓿根中柱和田间土壤)。

2.5 细菌遗传多样性

紫花苜蓿内生和非内生细菌遗传多样性丰富，在各栽培区域、苜蓿品种和部位存在差异(表4)。区域以甘肃武威细菌多样性最丰富，多样性(H=4.198)和丰富度(S=10)指数最高；其次为会宁和兰州，多样性指数分别为4.029和3.758。品种以WL168HQ苜蓿多样性最丰富(H=1.807)，甘农3号苜蓿多样性指数最低(H=1.388)。由于种子内只有1株菌，所以此部位未列入多样性计算中。田间土壤多样性(H=1.882)和丰富度(S=9)指数最高，多样性最丰富；其次为根表皮和根中柱，多样性指数均为1.831；花和茎内细菌多样性最低(H=0.693)。紫花苜蓿非内生细菌种的多样性(H=1.997)比内生细菌(H=1.885)更丰富。种内16S rRNA PCR-RFLP类型多样性而言，R.radiobacter菌株比E.meliloti菌株多样性更丰富，前者多样性(H=2.191)，丰富度(S=12)和均匀度(E=5.444)指数明显大于后者。

2.6 根瘤菌结瘤基因和固氮基因序列分析

对55株根瘤菌株进行nodC和nifH基因序列系统发育分析，仅有30株内生E.meliloti菌株能够扩增nodC和nifH基因并进行测序，所有R.radiobacter、R.rosettiformans(WTT6)、P.catacumbae(LL3和QP2)以及E.meliloti菌株G3T2和LL1未扩增到nodC和nifH基因。在nodC基因序列拓扑结构中(图2a)，30株E.meliloti菌株聚在一个分支，其nodC基因序列100%相似。与nodC基因系统发育树相比，菌株在nifH基因序列拓扑结构中分散在不同的分支。除菌株G9L5、G3L6、G3L11、LL11、G9L8、G3L2、G3L7和G3L5没有与参比菌株聚群外，其余菌株的nifH基因序列分别与E.melilotiSMX23-1(QL5、G9L4、QL2、LL10)、CCBAU 75245(G9L7)、SMX12-1(G3L10、LL5、LL8)、M2MS01(G9L3)、SMX10-4(G9L6)、KH21(LL6)、CCBAU 65135(G3L13)、CCBAU 83493(G3L3、LP3、G3L8、G3L9)、RP254(LL2、G3L12)、CCBAU 05047(WLG1)和CCBAU 15508(G3L4、QL4、WLP2)相似性最近(大于97%)(图2b)。E.meliloti菌株nifH基因多样性高于nodC基因。

图2 根瘤菌株nodC基因和nifH基因序列系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree based on sequences of nodC (a) and nifH (b) genes of rhizobial isolates

2.7 根瘤菌株促生能力

溶磷和分泌生长素IAA能力测定表明，部分菌株(18/38)具有2种促生能力(表5)。内生和非内生根瘤菌分泌生长素能力较强，27/38的菌株能产生IAA。5株E.meliloti菌(G3L3、G3T2、G9L8、LL2、WLP2)和7株R.radiobacter菌(G3G2、G3T1、G9TT4、G9TT5、LP4、LT3、WTT1)分泌IAA能力最强，5株E.meliloti菌(G3L5、G9L6、LL5、LL6和LL10)分泌IAA能力中等，10株E.meliloti菌(G3L4、G3L6、G3L8、G3L10、G3L12、G9L3、G9L4、LL11、QL4、QL5)分泌IAA能力低。

溶磷能力是根瘤菌株第2普遍的促生属性(24/38)，其中22/24和13/24的菌株分别具有溶解有机磷和无机磷的能力。菌株LL11和WLL3具有最强和最弱的溶解有机磷能力，溶磷圈D/d分别为4.01和1.01。这2株菌以及菌株G3L11、G9L5、G9TT5、LL1、LL2、LL6、LP4、LT3和WLG1仅能溶解有机磷，没有溶解无机磷的能力。在具有无机磷溶解能力的菌株中，除菌株QL2和WTT1不能溶解有机磷外，其余所有菌株既能溶解有机磷又能溶解无机磷。其中QL2溶解无机磷能力最强，溶磷圈D/d值(1.91)显著大于其余所有菌株。

表4 菌株遗传多样性Table 4 Genetic diversity of bacterial strains

表5 细菌溶磷和分泌IAA能力Table 5 Phosphate solubilization and IAA production capacity of different strains

注：D表示溶磷圈直径，d表示菌落直径；同列不同小写字母表示菌株处理间差异显著水平(P<0.05)；N代表菌株没有溶磷能力；-没有分泌IAA能力；+ 分泌IAA能力低，++ 分泌IAA能力中等，+++ 分泌IAA能力强

3 讨论

3.1 不同来源紫花苜蓿内生和非内生细菌遗传多样性

以甘肃省3个栽培区域5个紫花苜蓿品种为寄主植物，旨在揭示紫花苜蓿内生和非内生细菌的遗传多样性。细菌种群多样性受到土壤类型和植物基因型的影响[33]。从土壤类型分析，武威和会宁地区的菌株遗传多样性最丰富，兰州地区菌株遗传多样性最低；从植物基因型分析，生长于兰州地区的WL168HQ苜蓿菌株遗传多样性最丰富，生长于武威地区的甘农3号苜蓿菌株多样性指数最低。说明土壤类型和植物基因型对细菌种群多样性的影响并不是一致的。

从部位组织分析，根瘤中菌株最多(39%)，其次为田间土壤(18%)、根表皮(17%)和根中柱(9%)，根际土壤(11%)中菌株数量几乎是根瘤的1/4。有研究报道根瘤、根表皮和根中柱以及地上组织内生菌株种群多样性丰富[19]，并且相比土壤和根瘤，植物根系表面尤其是表皮和中柱的细菌在种和种内水平上多样性要更丰富[34]。而研究田间土壤细菌遗传多样性最丰富，根际土壤的细菌多样性也高于根瘤、花和茎；内生细菌遗传多样性明显低于非内生细菌，说明植物组织微环境对菌株在各种生态位中存在的影响小于土壤环境[35]。来自花和茎的菌株数量和多样性指数相同，共占总菌株的4%，来自种子的菌株最少(1%)。虽然植物地上组织尤其是叶片包含复杂并高度多样化的细菌种群[36]，但是此次研究没有从植物叶片中分离到内生细菌。这可能与非生物和生物环境因子[7]、不同植物组织中微环境的差异[34]以及试验地样本采集和室内细菌分离之间的较长时间延误等因素有关。

3.2 α-变形菌纲是紫花苜蓿内生和非内生细菌的主要组成

研究的所有菌株分别属于α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)的2个目3个科4个属5个种、芽孢杆菌纲的1个目3个科4个属4个种、Γ-变形菌纲的2个目3个科6个属7个种和β-变形菌纲的1个目1个科1个属1个种。其中α-变形菌纲在根瘤中占优势(占总菌株的33%)，在根际土壤、根表皮、田间土壤、根中柱、茎和种子内也有发现(20%)。芽孢杆菌纲(Bacilli)在根表皮特别丰富，同时在根瘤、田间土壤、花、根际土壤、中柱中也有分布(24%)。Γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)存在于根际土壤、根表皮、根瘤、田间土壤、茎、中柱和花(18%)。β-变形菌纲(Betaproteobacteria)仅在中柱中发现，但是也不能排除其生态位中少量存在的可能性(1%)。定殖于紫花苜蓿各部位组织的内生和非内生细菌种群中α-变形菌纲占优势，且细菌种群在科、属、种水平上有鲜明的特征[37]。同时细菌种群多样性与部位组织没有直接关联，说明细菌基因组的结构和功能也会造成本地细菌种群内部多样化[38]。

3.3 Ensifer meliloti和Rhizobium radiobacter是甘肃省紫花苜蓿内生和非内生细菌的优势种

除Phyllobacteriaceae和Sphingomonadaceae以外，α-变形菌纲中同一个种的根瘤菌株遗传多样性丰富。其中丰度最大的种为E.meliloti(32株)，数量占所有菌株的31%。就16S rRNA RFLP酶切类型而言，E.meliloti在根瘤中高度多样化，在根表皮、根中柱和田间土壤内多样性较差。对E.meliloti非内生和内生[19，39]根瘤菌种群结构的研究已有报道。试验中E.meliloti菌株主要分布在地下(根际土壤、根瘤、根表皮和根中柱)而不是地上(花、茎、叶和种子)组织，并且种内16S rRNA RFLP类型多样性比R.radiobacter低，说明E.meliloti在各微环境内(土壤、根瘤、根表皮、根中柱和其他地上组织)的定殖互作相对比较简单，遗传物质的随机漂移对种群结构的影响较小[19]。

R.radiobacter是此次研究α-变形菌纲中第2丰富的种(20株)，数量占总菌株的19%，在除叶以外的所有部位和组织均有分布。R.radiobacter种内16S rRNA RFLP类型多样性最丰富，共有12种RFLP类型分布在根瘤(3种)、根中柱(3种)、田间土壤(3种)、根表皮(2种)、根际土壤(2种)、茎(1种)和种子(1种)。R.radiobacter在紫花苜蓿各部位组织的广泛分布和多样化说明这种微生物似乎能很好的适应甘肃省生境。

3.4 内生和非内生根瘤菌E.meliloti共生基因多样化程度不同

55株内生和非内生根瘤菌中仅有30株E.meliloti内生菌能够扩增到nodC和nifH基因，菌株间基因序列相似性达到97%～100%，说明nodC和nifH基因均是从单一祖先水平转移而来。研究表明E.meliloti所属α-根瘤菌的共生基因是与携带这类基因的共生质粒操纵子共同进化的[40]，因此E.meliloti种内共生基因的水平转移可能是菌株共生能力传播的重要机制。5个苜蓿品种的内生E.meliloti根瘤菌在nodC基因序列系统发育树中形成了一个明显分离的集群，在nifH基因系统发育拓扑结构中与不同的参比菌株聚群，说明E.meliloti种内nifH基因多样性高于nodC基因，nifH基因更适合用于根瘤菌株共生特性的遗传基础研究[41]。

Estrella[40]和Aserse[13]等的报道，由于菌株间共生基因差异较大，所以即使应用了各种不同的引物组合，也不能从Rhizobium属、Mesorhizobiumsp.ERR6和Rhizobiumsp.IAR30根瘤菌中扩增到nodC和nifH基因。试验R.rosettiformans(WTT6)、P.catacumbae(LL3和QP2)以及E.meliloti菌株G3T2和LL1未扩增到共生基因，原因可能是这些菌株与其他根瘤菌株在结瘤基因和固氮基因方面存在差异。早期的分类体系将R.radiobacter归于Agrobacterium属，因此R.radiobacter菌株不能结瘤固氮，不能扩增到nodC和nifH基因，与此次研究结果一致。

3.5 内生和非内生根瘤菌E.meliloti和R.radiobacter促生能力有差异

植物生长激素吲哚乙酸(IAA)，能够促进细胞伸长，有效增加植物根系长度[42]。磷元素能够促进作物根系生长，并参与光合作用，是植物不可缺少的营养元素[13]。研究内生和非内生根瘤菌株具有分泌IAA、溶解有机磷和无机磷的能力，与Li等[43]的研究结果一致。E.meliloti菌株分泌IAA能力最普遍，R.radiobacter菌株次之。内生根瘤菌株中21/45的菌株能够分泌IAA，分泌能力中等或较低(尤其是根瘤中菌株)；非内生根瘤菌株中5/10的菌株能分泌IAA，且能力较强。IAA能够促进植物修复，使得细菌容易通过植物防御机制[13]，这也是内生和非内生细菌能够普遍分泌IAA的原因。

在不同根瘤菌种内，R.radiobacter菌株溶解有机磷和无机磷能力最强，其次为E.meliloti菌株。溶磷能力以非内生根瘤菌株溶解有机磷和无机磷能力比内生根瘤菌株更普遍。研究表明存在本土豆科植物的区域含有生理特征差异明显的根瘤菌种群[44-45]，这可能是此次试验R.radiobacter和E.meliloti菌株分泌IAA和溶磷能力不同的原因。Silva等[46]报道内共生环境与土壤的多样化是维持代谢能力巨大差异的一个主要原因。试验内生和非内生根瘤菌株促生能力分析说明遗传多样性丰富的非内生根瘤菌株分泌IAA能力更强，溶解有机磷、无机磷能力更普遍，这与以上研究结果一致。