不同载体研制的微生物接种剂对苏丹草生长和品质及土壤微生物数量影响

张建贵，韩华雯，姚 拓，李海云，胡彦婷，马亚春，杨琰珊，董 凯，崔文平，(.甘肃农业大学 草业学院/草业生态系统教育部重点实验室/甘肃省草业工程实验室/中-美草地畜牧业可持续发展研究中心,甘肃 兰州 730070； .甘肃农业大学 林学院，甘肃 兰州 730070)

微生物接种剂在农业领域应用技术已逐步成熟，广泛应用于多种牧草、粮食作物、蔬菜和中草药等领域。研究表明，大豆植株接种根瘤菌和假单胞菌，大豆磷含量、铁离子含量分别提高了88.9%、115.7%，且其全碳、全氮和豆血红蛋白的含量以及根瘤数目均有增加[1]。Abbasi等[2]从小麦根际分离出具有分泌IAA功能的细菌并接种于小麦根际，发现该菌对小麦促生效果明显，给辣椒接种芽孢杆菌(Bacillus)后辣椒产量和次生代谢产物(包括吲哚乙酸、铁载体和几丁质酶)含量均可增加[3]。

岷山红三叶施用复合菌肥能提高生产性能和营养品质，苜蓿施用PGPR菌肥其产量可提高30.1%、粗蛋白提高20.1%，而粗纤维含量显著降低[4-5]，玉米接种微生物接种剂后其株高、生物量、土壤养分含量均增加，同时土壤病原菌数量在减少，箭筈豌豆接种微生物接种剂后与不接种相比其根系活力增加38.3%，且幼苗高度、生物量均有增加[6-7]。微生物接种剂既能提高植物产量和品质，又能改善土壤结构增加土壤微生物数量。新垦地接种微生物接种剂后，土壤全氮、全磷分别提高58.8%和8.0%[8]。高温闷棚施用生物菌肥可使植物根际的细菌数量增加68.2%～84.1%，其种植的黄瓜、甜椒产量分别提高了7.68%、5.54%[9]。

为实现我国化肥使用零增长的目标，恢复土壤原生态结构，尤其是在长期施用化肥地中使用接种剂可使土壤结构向恢复的方向发展。而接种剂作用效果除了与菌株的来源、特性、有效活菌数和载体性质有关，还与土壤养分、水分、温度、湿度和pH等有关，此外接种剂施用方式、施用量和使用季节也决定接种剂的使用效果。

试验利用甘肃农业大学草业学院微生物课题组PGPR资源库的优良菌株，选用农业废弃物(花土、马铃薯渣、木炭、泥炭和菌糠)作为微生物接种剂载体，探究不同材料载体研制的的微生物接种剂对苏丹草生长和品质以及土壤养分、土壤3大微生物数量的变化，以期筛选出苏丹草最适微生物接种剂的载体，为禾本科牧草增产、增效提供科学的理论依据。

1 材料和方法

1.1 研究区概况

试验区地位于定西市安定区香泉镇，地理位置N 35°33′，E 104°35′，海拔1 896.7 m，光照充足，干旱少雨，蒸发强烈，属典型的半干旱区。年日照为2 433 h，年均降水量383.8 mm，年均气温6.7℃，7月最高平均气温25.9℃，1月最低平均气温-13.0℃。夏、冬两季月平均降水量分别为150～270 mm、20～80 mm。7～10月的降水量占年降水量的86.9%，潜在蒸发量年平均高达1 500 mm。土壤类型以黄绵土为主，肥力均匀地势平坦，土壤全氮、碱解氮、有机质、有效磷、全钾和速效钾含量分别为0.78 g/kg、48.00 mg/kg、10.37 g/kg、13.35 mg/kg、22.40 g/kg、204.00 mg/kg，pH 7.68。

1.2 供试品种及菌株

供试品种为大力士苏丹草(Sorghumsudanense)作为旱区高产稳收的一年生禾本科优质牧草，其适应性强，饲用价值高，适用于调制干草、青饲和青贮等。

供试菌株由课题组PGPR资源库提供(表1)，菌株具备固氮、溶磷、分泌IAA特性及生长快、竞争强、菌落形态明显等特点。

表1 菌株特性Table 1 Strains characteristics

1.3 微生物接种剂制备、施用及设计

Jm170，G、Lx191和Jm92菌株分别接种于LB液体摇瓶中，接菌的摇瓶置于转速200 r/min，温度30℃摇床中培养48 h，待各摇瓶的细菌数量至108cfu/mL即可使用。混合功能菌液为接不同菌株的菌液以一定比例(1∶1∶1∶1)混合均匀。用不同配比载体接混合功能菌制作微生物接种剂，将制作好的微生物接种剂置于28℃培养箱中培养7～10 d，待用。

选粒大饱满的苏丹草种子(无农药包衣)与接种剂混合均匀，且种子与接种剂质量比4∶11[7]，对照处理种子用无菌水拌种。种子与接种剂混合均匀后置于阴暗处处理2 h。过磷酸钙(P2O5≥14%)以75 kg/hm2的施肥量作基肥，苏丹草各生育时期均不追肥，但根据当地雨水情况，可进行田间常规灌溉。

试验采用田间沟垄覆膜(宽1.2 m)种植。播种为穴播、播种量13.3 kg/hm2，苏丹草行距和株距分别为40 cm和60 cm。试验采用随机区组设计，9个处理，6个重复，54个小区，每个小区面积30 m2(表2)。

表2 试验处理Table 2 Experimental treatments

1.4 苏丹草营养品质，土壤速效养分和土壤3大类微生物数量测定

苏丹草株高和干鲜比分别于孕穗期测定，每个小区重复10次；每个小区随机取2 m×2 m的样方进行齐地刈割，风干至恒重用于测定干草产量。将干草粉碎过筛(孔径0.5 mm)用于测定粗蛋白(凯氏定氮法)和全磷(氢醌-亚硫酸钠法)。

孕穗期取苏丹草根部土壤(0～30 cm)样品用于土壤速效钾、有效磷含量测定，每个小区随机取10个样点。速效钾含量采用醋酸铵-原子吸收分光光度计法进行测定，有效磷含量采用高锰酸钾氧化-葡萄糖还原法进行测定。

各地区要成立由草原行政部门主要领导、分管领导参加的草原鼠灾防治指挥部，夯实工作责任，认真组织落实草原鼠害防治工作；要结合当地实际制定项目实施方案，抓住关键时期和重点环节，细化防治目标和任务，提出资金使用意见，加强督促和指导，落实各项工作措施。

将苏丹草根部土壤(0～20 cm)样品用于土壤3大微生物数量测定，其中牛肉膏蛋白胨琼脂培养基用于测定细菌数量，改良高氏一号培养基用于测定放线菌数量，马丁-孟加拉红培养基用于测定真菌数量。

N=M×鲜土重/干土重

式中：M=a×u/v，N为每1 g干土的菌数；M为每1 g鲜土的菌数；v为每个培养皿中加悬浮液体积(50 μL)；a为培养皿中平均菌落数；u为稀释倍数。

1.5 数据分析

试验数据采用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析法，Duncan新复极差法进行差异显著性检验，用Excel 2010制图。

2 结果与分析

2.1 不同载体研制的微生物接种剂对苏丹草农艺性状的影响

2.1.1 对苏丹草株高的影响 孕穗期苏丹草的株高由高至低的处理依次为F2>F3>F1>F6>MR>CK>F4>F5>P，其中，F2和F3的株高较高，分别为320 cm和318 cm，而P处理苏丹草株高最低，为291 cm。各处理苏丹草的株高较P处理高6.38%～12.68%，各处理(除P，F4和F5)株高较CK提高了1.99%～5.39%，F2和F3的株高均显著高于P(P<0.05)，其余各处理与CK相比差异不显著(P>0.05)(图1-A)。

2.1.2 对苏丹草干鲜比的影响 不同接种剂处理对苏丹草干鲜比变化明显，孕穗期不同处理的苏丹草干鲜比由高至低依次为0.34% (F1)> 0.24%(F4)> 0.23% (CK)> 0.22% (P、MR)> 0.21% (F3、F6)> 0.19% (F2)> 0.18% (F5)。F1的干鲜比与CK相比差异显著且提高了47.82%(P<0.05)、与F5存在显著差异且较F5提高了85.45%(P<0.05)，F4干鲜比虽高于CK但差异不显著(P>0.05)，而其余处理均不及CK(图1-B)。

2.1.3 对苏丹草干草产量的影响 不同微生物接种剂处理下苏丹草的干草产量(103kg/hm2)由高至低依次为39.25 (F1)>38.83(F4)>38.80 (P)>38.73 (MR)>38.65(F3)>38.63(F5)>38.60(F6)>38.50(F2)>38.43(CK)。各处理与CK相比，施用接种剂苏丹草干草产量可提高0.17%～2.12%，F1、F4处理的苏丹草干草产量分别是P处理的1.01倍、1.00倍。可见，不同微生物接种剂均能显著提高苏丹草干草产量，其中，F1、F4对苏丹草干草产量促进效果最好(图1-C)。

图1 不同微生物接种剂处理下苏丹草的农艺性状Fig.1 The effects of different microorganism inoculants on agronomic traits

2.2 不同载体研制的微生物接种剂对苏丹草营养品质的影响

2.2.1 对苏丹草粗蛋白质含量的影响 苏丹草粗蛋白含量从高至低的处理依次为F1>F4>F6>F3 >MR>P>F2>F5>CK。其中，F1处理粗蛋白含量最高，为9.55%，较CK提高了15.3%，F3为9.03%，CK粗蛋白含量最低，为8.21%。不同接种剂(除F2和F5)较P高1.6%～12.2%，除P和F2与CK表现差异不显著，其余处理均与CK差异显著(P<0.05)。接种剂F1，F6和F4对苏丹草粗蛋白具有显著提高效果(图2-A)。

2.2.2 对苏丹草全磷的影响 不同接种剂对苏丹草全磷含量均有影响，全磷含量由高至低的处理依次为F5>F6>MR>F1>F4>F3>CK>P>F2。各接种剂处理(除P、F2外)较CK全磷含量可提高6.7%～26.7%，F2最低为0.26%，F5含量最高，为0.38%，F5与CK存在显著差异(P<0.05)，其余处理均与CK差异不显著(图2-B)。

图2 不同微生物接种剂处理下苏丹草的营养品质Fig.2 The effects of different microorganism inoculant on nutritional quality

2.3 不同载体研制的微生物接种剂对苏丹草土壤速效养分的影响

2.3.1 对苏丹草土壤有效磷的影响 不同接种剂对苏丹草土壤有效磷含量的变化均有影响。施用接种剂后土壤有效磷含量由高到低的处理依次为F4>F3>F5>F1>MR>P>F6>F2>CK，不同接种剂较CK可提高9.5%～45.2%，除F2和F6与CK差异不显著，其余各处理与CK均表现显著差异(P<0.05)。与处理P相比，其余各处理(除F2和F6)均可提高4.2%～20.9%。不同接种剂对土壤有效磷含量的提升效果较好的依次为F4(5.78 mg/kg)>F3(5.67 mg/kg)>F2(4.50 mg/kg)(图3-A)。

图3 不同微生物接种剂处理下苏丹草的土壤速效养分含量Fig.3 The effects of different microorganism inoculant on soil available nutrient

2.3.2 对苏丹草土壤速效钾的影响 不同接种剂对苏丹草土壤速效钾含量影响不同，施用接种剂后土壤速效钾含量由高到低的处理依次为F3>F5>P>F4>F1>MR>F2>F6>CK。其中，F3的土壤速效钾含量显著高于CK且其值为130.4 mg/kg(P<0.05)，与P相比土壤速效钾含量可提高5.3%。各接种剂(除F6)速效钾含量较CK均可提高2.2%～13.5%，除F3外，其余接种剂均与CK差异不显著(P>0.05)。因此，接种剂F3、F5对土壤速效钾提升效果较显著(图3-B)。

2.4 不同载体研制的微生物接种剂对苏丹草土壤微生物的影响

不同接种剂处理的苏丹草土壤微生物总数(×105cfu/g)依次为F3(25.49)>F6(12.02)>F4(8.87)>F1(8.20)>P(4.96)>MR(4.80)>F2(3.82)>CK(3.47)>F5(2.45)。其中，施用接种剂土壤放线菌数量是CK的2.3～6.9倍，F3最高(1.25×105cfu/g)，F6最低(0.41×105cfu/g)；施用接种剂土壤放线菌数量均显著高于CK(P<0.05)，除F2、F5土壤细菌数量是CK的1.11～7.37倍，其中，F3数量最高(24.25×105cfu/g)，F5最低(1.85×105cfu/g)，土壤细菌数量MR，F2和F5均显著高于CK(P<0.05)；施用接种剂土壤真菌数量是CK的6～30倍，其中F3真菌数量最高(1.50×103cfu/g)，F2、F5最低(0.30×103cfu/g)，土壤真菌数量均显著高于CK(P<0.05)。施用接种剂可改变土壤微生物数量，其中F3处理土壤微生物数量最多(表3)。

表3 不同微生物接种剂处理下苏丹草土壤的微生物数量Table 3 The effects of different microorganism inoculant on soil microorganism of Sudan grass (cfu/g)

3 讨论

3.1 微生物接种剂使用与苏丹草农艺性状、营养品质的关系

用不同载体研制的微生物接种剂对苏丹草株高和干鲜比均有促生效果，但差异不明显，而F1、F3处理苏丹草株高可增高2.9%，F1、F4对苏丹草干草产量增产效果较好，均在10%，这与姚拓等[10]、席琳乔等[11]研究发现从禾本科(草坪草，燕麦和小麦)植物根际分离的联合固氮菌制成的微生物接种剂作用于该植物可显著提高其株高和产量的研究结果相一致。微生物接种剂F1，F3和F4对苏丹草促生效果较显著，出现这一结果可能是这3种接种剂的载体更适于微生物生长繁殖，其繁殖过程中不仅能分泌GA，ABA和CTK等生长激素，还能为植物补充营养元素、调控植物生长，故而达到增产效果[12]，然而施用F2接种剂的效果不明显，可能是因为农业废弃物载体马铃薯淀粉渣空隙大、保水性差，不易混合功能菌在该载体上存活，从而影响其应用效果，或该接种剂有益菌在植物根际定殖能力较低而无法发挥作用。植物根际的细菌既能促进植物吸收微量元素锰，又能调控土壤中锰的还原，锰作为酶的活化剂在植物光合作用、N代谢中发挥极其重要的作用[13]。周毅等[14]选用溶磷微生物有机肥对冬小麦产量进行试验，结果表明解磷微生物有机肥对冬小麦增产达到8.7%。试验表明，不同接种剂对苏丹草的粗蛋白和全磷含量影响明显，表现在复合载体接种剂>单一载体接种剂>CK，其原因可能为复合载体接种剂更适于PGPR生长繁殖进而间接提高苏丹草营养品质；施用不同接种剂可提高苏丹草粗蛋白含量1.0%～15.3%，其中F1、F3效果较好，这一结果与有关学者对联合固氮菌来源于水稻根际并接种于水稻的研究发现可提高水稻植株粗蛋白含量(P<0.05)的结果一致[15]，Hodencia等[16]的关植物根际促生菌对番茄果实品质研究发现，接种植物根际促生菌可有助于提高番茄果实的质地和大小的结果相近。此外，冯瑞章等[17]研究表明，磷矿粉在溶磷菌和固氮菌协同作用下溶解效果显著优于溶磷菌单独培养效果。出现这一结果与接种剂载体、菌株特性有关，或与混合功能菌分泌物会弥补单一接种的缺陷的机理有关，其分泌物会促进土壤微生物氮素生理群生长繁殖，加速土壤氮循环，故而促使植物对氮的吸收利用[18]，而接种剂对植株的全磷含量影响不显著，可能因为土壤磷素含量已达到植物需求，接种剂里的溶磷菌在土壤中溶解的磷不能被植物反映。

3.2 接种剂施用与土壤速效养分的关系

施用接种剂可提高土壤养分从难溶性向可溶性转化的速率，促使土壤肥力向养分富集化方向发展，韩光等[8]表明新垦地接种复合PGPR接种剂可显著提高土壤速效养分，也有学者发现油菜与解磷菌肥拌种能够提高土壤养分含量(如速效钾、碱解氮、速效磷)，提高土壤脲酶和磷酸酶活性，特别是在低磷、中磷水平条件下溶磷菌群表现效果更为突出，溶磷菌肥应用具有重要的经济价值[19]。研究表明，不同接种剂对土壤速效养分有着不同程度的变化，与CK相比可提高土壤有效磷、速效钾(除F6)9.5%～45.2%、2.2%～13.5%。这与逄焕成等[20]研究有关添加解钾菌与芽孢杆菌的制成的微生物接种剂处理的土壤，其有效磷含量可提高71.4%、有机质提高55.9%、速效钾提高28.9%和碱解氮提高50.2%的研究结果一致。聂文翰等[21]通过复合接菌剂秸秆堆肥对土壤碳、氮含量和酶活性的影响研究发现，施用复合接菌剂不仅提高土壤酶活性还能提高土壤氮素、磷素、钾素的含量。经对比发现复合载体接种剂的有效活菌数优于单一载体接种剂，更优于对照，进一步验证了有效活菌数决定微生物接种剂作用于大田的效果。

3.3 接种剂施用与土壤微生物的关系

土壤微生物是衡量土壤活力的重要指标，有学者发现在晚稻上施用多功能微生物复合菌肥可大幅度提高土壤微生物优势菌群的数量[22]。试验表明，施用接种剂对土壤微生物数量影响显著，其中，细菌数量增长较显著，放线菌和真菌也略有增长，但各试验小区未发现植物病害发生，其中F3土壤微生物数量增长最明显。这与张丽娜等[23]研究施用微生物菌肥后萝卜各生育时期微生物数量均高于对照的结果相一致，与尹淑丽等[24]研究发现施入复合微生态菌剂后可显著提高土壤中细菌和放线菌的数量的结果相一致，出现这一结果可能因为菌肥的施入给植物带入外源促生菌。孙广正等[25]研究报道施用微生物接种剂能抑制西葫芦根腐病的发生且抑制率达到66.80%，同时可替代15%的化肥投入也能达到促生的效果。可见，施用菌肥既能抑制病原菌的生长，又能促进土壤微生物多样性的提高。有报道，微生物接种剂对土壤本土微生物习性影响较小，外来接种的促生菌不会对土著微生物种群造成负面影响[26]。土壤是一个神秘“黑匣子”，维持土壤微生态平衡，研究表明接种微生物接种剂可引起土壤微生物构成发生极小部分的变化，但施用接种剂后土壤微生物群落结构变化尚未清楚，需进一步采用荧光标记、高通量等技术进行深入研究。

4 结论

用不同载体研制的微生物接种剂不仅对苏丹草的生长和品质以及土壤养分有一定的影响，而且可调控土壤的微生物区系，抑制病原菌的生长。

(1)利用F1，F3和F4配方作为载体研制的的微生物接种剂对苏丹草的农艺性状和品质均有促进作用。其中，F1、F3与CK相比其株高分别提高了2.91%、5.00%，F1、F4的粗蛋白含量与CK相比分别增加了15.32%、12.31%。

(2)对土壤养分和微生物数量变化有较明显影响的处理有F3，F4和F5。其中，F3、F4载体微生物接种剂的土壤有效磷含量较CK提高了46.25%、44.58%，F3、F5土壤微生物数量较CK提高了12.09%、8.89%。

(3)综合分析，利用F3(40%木炭+40%泥炭+20%花土)作为微生物播种的载体比其他载体配方对苏丹草生长、土壤养分及微生物数量有较好的促生效果。因此，F3可作为苏丹草微生物接种剂的专用载体。