高血糖状态结直肠癌相关基因的验证及其诊疗效能评估

崔 戈，冯文明，张 婷，朱国良，石麒麟，张晓岚，夏 慧

湖州师范学院附属第一医院 1病理科 2外科，浙江湖州 313000 3湖州师范学院医学院病理教研室，浙江湖州 313000

结直肠癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一。流行病学研究显示8.1%～18.0%的结直肠癌患者并发糖尿病[1-4]；高血糖状态是结直肠癌发生发展的独立风险因子，与非糖尿病患者相比，2型糖尿病患者具有更高的结直肠癌发生率、更差的预后和更高的死亡率[1-5]。高血糖状态结直肠癌患者肿瘤直径更大、分化程度更差[6]，提示血糖状态与结直肠癌的恶性程度密切关联。2型糖尿病与结直肠癌具有诸多共同发病因素,如肥胖、高热量饮食、缺乏运动等[1-4]，但糖代谢异常与结直肠癌发生发展存在的内在关联尚不十分明确。对不同血糖状态结直肠癌进行差异性表达基因筛选、大样本量验证及功能机制研究，寻找特异性标志分子和关键调控因子，对糖代谢异常相关结直肠癌的早期筛查、揭示关键分子作用、构建个体化分子靶向治疗策略均具有重要意义。国外有全基因组关联研究报道了糖尿病与结直肠癌存在关联的某些基因，如转录因子7类似物2、电压依赖钾通道蛋白1、高迁移率族蛋白A2、Rho GTP酶结合蛋白及人骨形态形成蛋白拮抗蛋白1等[2]。目前国内未见关于不同血糖状态结直肠癌组织高通量转录组测序、信息学分析及大样本量组织表达验证的相关报道。本研究组前期采用Illumina Hiseq第2代测序平台对不同血糖状态的结直肠癌组织进行高通量转录组测序及信息学分析，筛选了一批在高血糖状态结直肠癌组织中显著高表达的基因，如葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78，GRP78)、NADPH 氧化酶-1(NADPH oxidase-1，NOX1)、癌胚抗原相关细胞黏附分子5(carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5，CEACAM5)、热休克蛋白60(heat shock protein 60，HSP60)、组蛋白去乙酰化酶1(histone deacetylase 1，HDAC1)，有研究表明上述基因与肿瘤的发生发展及能量代谢均存在关联[7-19]，可能是高血糖状态结直肠癌的潜在标志分子。本研究采用大样本量组织验证上述5种基因mRNA表达，分析其表达水平与临床病理参数的关联，采用诊断试验方法评价相关基因的诊断效能。

资料和方法

临床样本收集及预处理本研究经主管部门医学伦理委员会审查通过，所有样本提供者本人或其家属均签署知情同意书后，开展临床样本的收集及预处理工作。结直肠癌诊断标准：结直肠癌原发肿瘤手术切除样本经2位以上病理科高年资诊断医师诊断为“结直肠癌”，病理诊断结果作为定性“金标准”；上述确诊的结直肠癌患者为首次入院，未曾接受放射治疗、化学治疗或中医中药等任何肿瘤治疗；排除并发急慢性感染、脏器功能损害等其他病症。糖尿病诊断标准：经高年资临床医生结合临床症状及空腹血糖检验，结果符合WHO诊断标准[20-21]：糖尿病为空腹血糖≥7.0 mmol/L或有糖尿病症状，任何时间静脉血浆葡萄糖浓度≥11.1 mmol/L；高血糖状态为空腹血糖>6.1 mmol/L，正常人空腹血糖参考值为3.9～6.1 mmol/L。上述糖尿病患者未曾接受任何降糖治疗，并经影像学和/或活检病理诊断无伴发肿瘤病。健康志愿者样本：志愿者的体检结论为正常，血糖值正常，经其他检查未发现肿瘤、急慢性感染、脏器功能损害等其他病症。选取本院规范化临床生物样本库库存109例结直肠癌患者手术切除肿瘤组织、远端正常肠组织及其外周静脉血。另选取本院30例内分泌科糖尿病患者及30例健康志愿者，以乙二胺四乙酸二钾抗凝真空负压采血管收集空腹外周静脉血5 ml，离心后吸取血清，置于-80 ℃冰箱冻存备用。

血糖状态统计及临床样本分组采用葡萄糖氧化酶法检测上述样本提供者清晨空腹静脉血浆葡萄糖血糖值(单位mmol/L)，操作过程严格按照试剂盒说明书进行。临床样本分组：根据血糖状态及组织良恶性，将结直肠癌患者组织样本分为4组：伴发高血糖结直肠癌患者肿瘤组织(high glucose-tumor，HG-T)、伴发高血糖结直肠癌患者远端正常肠黏膜组织(high glucose-normal tissue，HG-N)、正常血糖结直肠癌患者肿瘤组织(normal glucose-tumor，NG-T)、正常血糖结直肠癌患者远端正常肠黏膜组织(normal glucose-normal tissue，NG-N)。血清样本分组：根据血糖状态及是否伴发结直肠癌，将外周血血清样本分为4组：HG-T组、NG-T组、糖尿病组、健康组。

实时荧光定量PCR使用ABI-7300实时定量检测仪(SYBR Green法)进行实时荧光定量PCR。取上述组织/血清样本经总RNA抽提试剂充分裂解，离心取上清，提取总RNA，逆转录成cDNA，进行PCR扩增。设计PCR引物：GRP78：上游5’ ATAGCAGAAGCCGACAGG 3’，下游5’ CCAGTGAGACCAGCAATG 3’，产物长度157 bp；NOX1：上游5’ ATAGCAGAAGCCGACAGG 3’，下游5’ CCAGTGAGACCAGCAATG 3’，产物长度157 bp；CEACAM5：上游5’ CAGCCTCACTTCTAACCTTC 3’，下游5’ TGCCATCCACTCTTTCAC 3’，产物长度165 bp；HSP60：上游5’ ATCAGGAGAGGTGTGATGTTAG 3’，下游5’ TCCGTTTGCAGAAATCGTAG 3’，产物长度117 bp；HDAC1：上游5’ GCTCCACATCAGTCCTTCC 3’，下游5’ GGTCGTCTTCGTCCTCATC 3’，产物长度176 bp；内参GAPDH：上游5’ CACCCACTCCTCCACCTTTG 3’，下游5’ CCACCACCCTGTTGCTGTAG 3’，产物长度110 bp。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应条件按照试剂盒要求操作，反应程序：95 ℃ 10 min(95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min)，40个循环；95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s；60 ℃ 15 s。实验重复3次。计算每个样本目标基因扩增达荧光阈值循环数(cycle threshold，Ct)及内参基因Ct值，mRNA表达水平以2-△△Ct法计算相关基因相对表达量，采用ABI Prism 7300 SDS软件分析结果。

结直肠癌患者临床病理参数统计并分析其与相关基因表达的关联统计入组结直肠癌患者临床病理参数：包括性别、年龄、肿瘤部位、大体分型、肿瘤直径、神经/血管累及、分化程度、原发灶浸润深度、淋巴结转移、远处转移、TNM分期。肿瘤病理类型及分化级别诊断标准参照2010年WHO肿瘤分类标准[22]确定。原发肿瘤(T)：T0：无原发肿瘤证据；Tis：原位癌；T1：肿瘤侵犯黏膜下层；T2：肿瘤侵犯固有肌层；T3：肿瘤穿透固有肌层到达浆膜下层或侵犯无腹膜覆盖的结直肠旁组织；T4：肿瘤穿透腹膜脏层或直接侵犯或黏连于其他器官或结构。区域淋巴结(N)：N0：无区域淋巴结转移；N1：有1～3枚区域淋巴结转移；N2：有4枚以上区域淋巴结转移。远处转移(M)：M0：无远处转移；M1：有远处转移。TNM分期参照2009年美国癌症联合委员会/国际抗癌联盟结直肠癌TNM分期系统(第7版)[23]登记。

统计学处理使用SPSS 23.0统计软件，组间各基因mRNA表达均值的差异性采用独立样本t检验比较，并进行Bonferroni校正，P<0.01为两组差异有统计学意义；结直肠癌患者血清样本中相关基因mRNA表达水平与临床病理参数变量间相关性采用Pearson相关性分析，统计相关系数r，P<0.05为差异有统计学意义。采用诊断试验方法计算相关基因在高血糖状态结直肠癌患者血清中表达的灵敏度、特异度、准确度、正确指数、阳性及阴性似然比、阳性及阴性预测值；以灵敏度为纵坐标、假阳性率为横坐标作图，绘制受试者工作特性曲线(receiver operating characteristic，ROC)曲线，计算ROC曲线下面积(area under curve，AUC)及其95%可信区间，以评价诊断效能并选择最佳诊断界限值。根据ROC曲线坐标结果，计算正确指数=敏感度-(1-特异性)，以最大正确指数对应的mRNA表达量作为诊断临界点。在病理诊断为“结直肠癌”患者的血清样本中，将mRNA表达量大于或等于诊断临界点者作为真阳性表达数(a)，小于诊断临界点者作为假阴性表达数(c)；在其他人群(正常血糖结直肠癌患者、糖尿病患者及健康志愿者)的血清样本中，将mRNA表达量大于或等于诊断临界点者作为假阳性表达数(b)，小于诊断临界点者作为真阴性表达数(d)，制作4格表，根据表格数据计算相应指标：灵敏度=a/(a+c)×100%；特异度=d/(b+d)×100%；准确度=(a+d)/(a+b+c+d)×100%；正确指数=[a/(a+c)+d/(b+d)]-1；阳性似然比=[a/(a+c)]/[b/(b+d)]×100%，阴性似然比=[c/(a+c)]/[d/(b+d)]×100%；阳性预测值=a/(a+b)×100%，阴性预测值=d/(c+d)×100%。分别通过平行实验、序列实验评价多个基因联合检测的诊断效能，筛选优化出灵敏度和特异度较高的标志组合。

结 果

结直肠癌患者血糖状态根据空腹血糖状态检测结果统计，109例结直肠癌患者中血糖正常者(空腹血糖状态为3.9～6.1 mmol/L)为75例，占结直肠癌患者总数的68.80%；高血糖状态者(空腹血糖>6.1 mmol/L)为34例，占结直肠癌患者总数的31.19%；其中并发糖尿病者(空腹血糖≥7.0 mmol/L并经临床确诊)为18例，占结直肠癌患者总数的16.51%。

不同血糖状态结直肠癌患者肿瘤与正常组织相关基因mRNA的表达分别对HG-T、HG-N、NG-T及NG-N组组织的mRNA表达量进行两两组间比较，采用t检验比较组间各基因mRNA表达均值的差异性，并经Bonferroni校正。结果显示，与远端正常肠黏膜组织相比，高血糖或正常血糖状态的结直肠癌患者肿瘤组织中的GRP78 (P=0.000，P=0.006)、NOX1(P=0.000，P=0.002)、CEACAM5(P=0.000，P=0.000)、HSP60(P=0.000，P=0.000)、HDAC1 (P=0.000，P=0.001) mRNA均显著增高。与正常血糖状态的结直肠癌肿瘤组织相比，NOX1(P=0.000)、HDAC1(P=0.030)在高血糖状态结直肠癌肿瘤组织中显著高表达，其余基因差异均无统计学意义；与正常血糖状态的结直肠远端正常组织相比，HDAC1在高血糖状态结直肠远端正常组织中显著高表达(P=0.017)(表1)。

不同血糖状态结直肠癌患者、糖尿病患者及健康志愿者血清相关基因mRNA表达差异分别对伴发高血糖结直肠癌患者、正常血糖结直肠癌患者、糖尿病患者及健康志愿者血清的mRNA表达量进行两两组间比较，采用t检验比较组间各基因mRNA表达均值的差异性，经Bonferroni校正。结果显示，与糖尿病患者及健康志愿者血清样本相比，不同血糖状态结直肠癌患者上述基因mRNA表达均显著增高；高血糖状态结直肠癌患者与正常血糖状态结直肠癌患者血清样本相比，NOX1(P=0.008)、HSP60(P=0.001)及HDAC1(P=0.000)基因mRNA表达显著增高，其余基因差异均无统计学意义(表2)。

不同血糖状态结直肠癌相关基因mRNA表达与临床病理参数的相关性在不同血糖状态结直肠癌相关基因mRNA表达与临床病理参数的相关性分析中，GRP78(P=0.001)、NOX1(P=0.022)、CEACAM5(P=0.000)、HSP60(P=0.044)、HDAC1(P=0.047)基因mRNA表达分别与空腹血糖状态呈显著正相关；GRP78 mRNA表达与结直肠癌血管累及呈显著正相关(P=0.016)，NOX1 mRNA表达与结直肠癌肿瘤直径呈显著正相关(P=0.013)，CEACAM5 mRNA表达与结直肠癌血管累及(P=0.036)、原发灶浸润深度(P=0.036)、TNM分期(P=0.014)均呈显著正相关；HSP60 mRNA表达与结直肠癌患者年龄呈显著正相关(P=0.030)；HDAC1 mRNA表达与结直肠癌发病部位(P=0.049)、原发灶浸润深度(P=0.025)、TNM分期(P=0.042)分别呈显著正相关(表3)。

表1 不同血糖状态结直肠癌患者肿瘤与正常组织相关基因mRNA相对表达比较Table 1 Comparison of mRNA relative expressions of genes between tumor and normal tissues in colorectal cancer patients with different blood glucose levels

GRP78：葡萄糖调节蛋白78；NOX1：NADPH 氧化酶-1； CEACAM5：癌胚抗原相关细胞黏附分子5；HSP60：热休克蛋白60；HDAC1：组蛋白去乙酰化酶1；HG-T：伴发高血糖结直肠癌患者肿瘤组织；NG-T：正常血糖结直肠癌患者肿瘤组织；HG-N：伴发高血糖结直肠癌患者远端正常肠黏膜组织；NG-N：正常血糖结直肠癌患者远端正常肠黏膜组织；t1、P1：HG-T比NG-T；t2、P2：NG-T比NG-N；t3、P3：HG-N比NG-N；t4、P4：HG-T比HG-N

GRP78：glucose regulated protein 78；NOX1：NADPH oxidase-1；CEACAM5：carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5；HSP60：heat shock protein 60；HDAC1：histone deacetylase 1；HG-T：tumor in colorectal cancer patients with high glucose levels；NG-T：tumor in colorectal cancer patients with normal blood glucose levels；HG-N：normal tissues in colorectal cancer patients with high blood glucose levels；NG-N：normal tissues in colorectal cancer patients with normal blood glucose levels；t1，P1：HG-Tvs. NG-T；t2，P2：NG-Tvs. NG-N；t3，P3：HG-Nvs. NG-N；t4，P4：HG-Tvs.HG-N

表2 不同血糖状态结直肠癌患者、糖尿病患者及健康志愿者血清相关基因mRNA相对表达比较Table 2 Comparison of mRNA relative expressions of genes in serum of colorectal cancer patients with different blood glucose levels，diabetic patients，and healthy volunteers

HG-T：伴发高血糖结直肠癌患者血清； NG-T：正常血糖结直肠癌患者血清；DM：糖尿病患者血清；N：健康志愿者血清；t1、P1：HG-T比NG-T；t2、P2：HG-T比DM；t3、P3：NG-T比N；t4、P4：DM比N；t5、P5：HG-T比N

HG-T：serum of colorectal cancer patients with high blood glucose levels；NG-T：serum of colorectal cancer patients with normal blood glucose levels；DM：serum of diabetic patients；N：serum of healthy volunteers；t1，P1：HG-Tvs. NG-T；t2，P2：HG-Tvs. DM；t3，P3：NG-Tvs. N；t4，P4：DMvs. N；t5，P5：HG-Tvs. N

表3 不同血糖状态结直肠癌相关基因表达与临床病理参数的相关性Table 3 Correlation of the expressions of genes associated with colorectal cancer and clinicopathological parameters in colorectal cancer patients with different blood glucose levels

不同血糖状态结直肠癌患者、糖尿病及健康志愿者血清样本相关基因mRNA表达的诊断试验评价受试者ROC曲线见图1，最大正确指数对应的mRNA表达量见表4。根据ROC曲线及AUC统计结果，NOX1、CEACAM5、HDAC1的AUC分别为0.931(P=0.000)、0.852(P=0.000)、0.860(P=0.000)。以诊断临界点作为判断依据计算4格表数值(表5)。诊断试验评价结果显示，NOX1、HDAC1在高血糖结直肠癌患者血清表达的特异度、准确度及阴性预测值均在90%以上(表6)。通过平行试验、序列试验评价多个基因联合检测的诊断效能，发现联合检测NOX1、CEACAM5、HDAC1对于高血糖结直肠癌患者的诊断效能分别具有更高的灵敏度(98.82%)和特异度(99.93%)(表7)。

ROC：受试者工作特性

ROC：receiver operating characteristic

图1高血糖状态结直肠癌患者血清样本相关基因表达的ROC曲线

Fig1ROC curves of the expressions of genes associated with colorectal cancer in serum specimens of colorectal cancer patients with hyperglycemia

表4 高血糖状态结直肠癌相关基因表达的ROC曲线下面积统计及诊断临界点Table 4 Area under ROC curves and cut-off values of the exressions of genes associated with colorectal cancer in colorectal cancer patients with hyperglycemia

表6 高血糖状态结直肠癌血清样本相关基因表达的诊断试验评价Table 6 Diagnostic test of genes associated with colorectal cancer in serum specimens of colorectal cancer patients with hyperglycemia

讨 论

本研究组前期研究显示结直肠癌患者中伴发高血糖者占29.67%，其中伴发糖尿病者占14.83%[6]。本研究显示，109例结直肠癌患者中血糖正常者占结直肠癌患者总数的68.80%，高血糖状态者占31.19%，其中并发糖尿病者占16.51%，本研究结果与前期报道基本一致。

笔者前期通过高通量转录组测序及信息学分析筛选了5种基因(GRP78、NOX1、CEACAM5、HSP60、HDAC1)，本研究采用实时定量PCR法在不同血糖状态结直肠癌组织及血液样本中验证上述基因的表达，发现上述基因mRNA表达与结直肠癌患者空腹血糖状态均呈显著正相关，可能与结直肠癌患者的糖代谢异常存在关联。

表7 高血糖状态结直肠癌血清样本相关基因联合检测的诊断试验评价(%)Table 7 Diagnostic test of combined detection of genes associated with colorectal cancer in serum specimens of colorectal cancer patients with hyperglycemia(%)

GRP78又称免疫球蛋白重链结合蛋白，是热休克蛋白70家族的成员之一，作为一种分子伴侣在蛋白质折叠转运、内质网应激与钙稳态及线粒体代谢调节中发挥重要作用[7-10]。GRP78在多种肿瘤组织中高表达[7-8]，可促进肿瘤细胞的侵袭转移10]。本研究显示GRP78表达可区分正常肠组织与结直肠癌组织，但并不能区分不同血糖状态的结直肠癌组织，不适宜作为高血糖状态结直肠癌相关基因。本研究显示GRP78 mRNA表达与结直肠癌血管累及呈显著正相关，GRP78可能参与了肿瘤细胞血管侵犯或血道转移过程。有报道GRP78促进肿瘤细胞迁移的作用可能与其第648位苏氨酸糖基化有关[10]。

NOX1是NADPH 氧化酶家族成员之一，是调节体内氧化还原反应的关键酶，参与介导糖尿病性动脉粥样硬化等病理损害[11]。本研究显示NOX1 mRNA在高血糖状态结直肠癌样本中表达的特异度、准确度及阴性预测值均在90%以上，可作为高血糖状态结直肠癌候选相关基因。笔者还发现NOX1表达与结直肠癌肿瘤直径呈显著正相关，NOX1可能参与了结直肠肿瘤细胞的增殖过程，其机制可能与作为癌基因c-Myb的下游靶基因有关，NOX1及c-Myb均在结直肠癌肿瘤组织中高表达[12]。

CEACAM5是人类组织和肿瘤细胞分化及增殖的重要调节分子，可作为结直肠癌肝转移早期复发的预测标志[13]，并在2型糖尿病血清中显著高表达[14]。本研究显示CEACAM5在结直肠癌样本中高表达，但在不同血糖状态肿瘤样本中的表达无差异，其mRNA表达与结直肠癌血管累及、原发灶浸润深度、TNM分期均呈显著正相关，CEACAM5与结直肠癌病程进展密切相关。

HSP60是一种主要存在于线粒体的伴侣蛋白，可抑制细胞凋亡，可通过促进免疫炎症、促进动脉粥样硬化形成参与糖尿病发生[15]，并与缺氧诱导因子2α存在蛋白相互作用[16]。本研究显示HSP60在不同血糖状态的结直肠癌样本中的表达无差异，其mRNA表达量随结直肠癌患者年龄增大而增高，可能与其参与多种慢性疾病的病理过程有关。

HDAC1是一类蛋白酶，参与调控染色体结构修饰、基因表达及细胞凋亡过程，在多种肿瘤组织中表达升高，下调HDAC1可抑制蛋白磷酸酶2A的癌性抑制因子转录，进而诱导结直肠癌细胞凋亡[17]。本研究显示HDAC1 mRNA在高血糖状态结直肠癌样本中表达的特异度、准确度及阴性预测值均在90%以上，可作为高血糖状态结直肠癌候选相关基因。本研究还显示HDAC1 mRNA表达与结直肠癌发病部位、原发灶浸润深度、TNM分期均呈显著正相关，与高血糖状态结直肠癌的病程进展具有密切关联。研究显示HDAC1与磷脂酰肌醇3-激酶信号通路存在关联[18]，HDAC1可能通过磷脂酰肌醇3-激酶信号通路参与调节肿瘤细胞代谢。目前组蛋白去乙酰化酶抑制剂已成为肿瘤药物研究热点[19]，开发针对HDAC亚型的特异性组蛋白去乙酰化酶抑制剂并明确其作用靶点将成为新的研究方向。

目前临床上常采用临床表现、家族史、影像学、结肠镜检查及血清肿瘤标志物检测进行结直肠癌的早期筛查[24-25]。但临床症状典型、影像学或内镜检查阳性者其肿瘤大多已发展到一定阶段，已失去最佳治疗时机；而癌胚抗原及糖蛋白抗原19-9等常规血清肿瘤标志物并不具备较高的组织特异性和诊断准确性；单个分子标志物的诊断灵敏度、特异性较低，容易造成漏诊或误诊。筛选出更高灵敏度、特异度的联合检测分子标志谱是肿瘤分子诊断的研究方向。本研究通过平行试验、序列试验评价多个基因联合检测的诊断效能，发现联合检测NOX1、CEACAM5、HDAC1对于高血糖结直肠癌患者的诊断效能分别具有更高的灵敏度(98.82%)和特异度(99.93%)。笔者建议在高血糖人群中加大结直肠癌的早期筛查力度，通过定期联合检测NOX1、CEACAM5、HDAC1的表达，密切监控其表达变化与诊断临界点的关系，结合其他早期诊断方法综合评价高血糖状态结直肠癌的发生发展，为高血糖状态结直肠癌的早诊、早治提供参考依据。

综上，本研究为合并糖代谢异常等高风险肿瘤亚型的诊疗提供了一种新思路，笔者将在表观遗传学、蛋白质组学、代谢组学等领域开展深入研究，发现高风险肿瘤亚型的高特异度、高灵敏度的标志分子，探讨其关键调控分子的作用机制，为构建个体化、精准化肿瘤防治策略提供实验依据。