草鱼鱼鳞胶原蛋白肽及其肽-钙螯合物 的结构表征

张琬悦 王诗瑶 杨平 徐昕 孙子涵

【摘   要】 本试验酶解草鱼鱼鳞胶原蛋白制备胶原蛋白肽，并以此为原料制备肽-钙螯合物，利用傅里叶红外光谱分析法、紫外光谱分析法和差示扫描量热分析法对所得胶原蛋白肽和肽-钙螯合物进行结构表征。

【关键词】 草鱼鱼鳞;胶原蛋白肽;肽-钙鳌合物;结构表征

Structural characterization of collagen peptide and its peptide-calcium chelate in grass carp scales

Zhang Wanyue   Wang Shiyao   Yang Ping   Xu Xin   Sun Zihan

（Grain College Of Shenyang Normal University   110000）

[Abstract]  In this experiment， collagen peptide was prepared by enzymatic hydrolysis of grass carp scale collagen protein， and then used as raw material to prepare peptide-calcium chelate. The structure of collagen peptide and peptide-calcium chelate was characterized by Fourier transform infrared spectroscopy， ultraviolet spectroscopy and differential scanning calorimetry.

[Keywords]  grass carp scale; collagen peptide; peptide-calcium chelate; structure characterization

近年来，胶原蛋白肽作为一种新型的功能食品配料在全球范围内得到广泛应用。它具有多种生物功效，其中鳌合钙的作用十分瞩目。研究表明，多肽鳌合钙比氨基酸鳌合钙更易吸收，是更为理想的促钙吸收制剂。本试验采用酶解法，以中性蛋白酶和复合蛋白酶酶解草鱼鳞胶原蛋白，利用中空纤维过滤组件过滤酶解液，得到分子量小于10KD的胶原蛋白肽，并以此为原料，制备肽-钙螯合物。利用傅里叶红外光谱分析法、紫外光谱分析法及差示热量扫描法对所得胶原蛋白肽及肽-钙螯合物的结构进行表征。

1  材料与方法

1.1  材料

草鱼鱼鳞 购于沈阳市小宝生鲜水产店;中性蛋白酶、复合蛋白酶，丹麦Novozymes公司;其余试剂均为国产分析纯。

1.2  主要设备

水浴恒温振荡器，北京中西远大科技有限公司;傅里叶红外光谱仪，瑞士Bruker公司; BCD-198SIEMENS冰箱，博西华家用电器有限公司;Scientz-12N冷冻干燥机，宁波新芝生物科技股份有限公司;MicroKros中空纤维过滤组件（10KD），上海瑞普利金生物科技有限公司;差式扫描量热仪，上海盈诺精密仪器有限公司;紫外分光光度计，济南思泉医疗机械公司。

1.3  试验方法

1.3.1 胶原蛋白肽的制备

1.3.1.1胶原蛋白的制备  参照文献[1]的方法，制得草鱼鱼鳞胶原蛋白。

1.3.1.2胶原蛋白肽的制备  将胶原蛋白配制成1mg/ml的悬浊液，加入中性蛋白酶及复合蛋白酶，调节PH至6.5，在55℃水浴恒温振荡器中酶解223min，反应结束后100℃水浴锅灭酶10min，得到初步酶解的胶原蛋白肽的溶液。待酶解液冷卻后用中空纤维过滤组件过滤酶解液。回收液经真空冷冻干燥得到草鱼鱼鳞胶原蛋白肽样品。

1.3.2 胶原蛋白肽-钙螯合物的制备

1.3.2.1 制备  参照文献[2]的方法，胶原蛋白肽溶液→调节螯合条件（温度42℃、p H6.8、投入氯化钙质量比2：1、时间50min）→螯合→3 倍无水乙醇沉淀螯合物→离心（8 000 r/min;10 min），收集沉淀→真空冷冻干燥

1.3.2.2 胶原蛋白肽与钙结合率的测定  采用EDTA络合滴定法。结果计算如下：

鳌合率/%=（m-m1）/m

螯合物中钙的质量分数/%=（m-m1）/（m2+m-m1） ×100%

m：钙离子总质量/mg

m1：游离钙离子质量/mg

m2：胶原蛋白肽质量/mg

1.3.3 胶原蛋白肽及其肽-钙螯合物的结构表征

1.3.3.1 差示扫描量热分析  称取样品5mg左右，用差示扫描量热仪进行扫描，温度范围50-150℃，加热速率为10℃/min。

1.3.2.2 傅里叶红外光谱分析  将1mg胶原蛋白肽及肽-钙螯合物样品分别与溴化钾粉末混合压片，在400～4 000 cm-1波数区间扫描，分辨率4cm-1。

1.3.2.3 紫外光谱扫描分析  分别将胶原蛋白肽及肽钙螯合物样品配制成1mg/mL的溶液。取适量该溶液在200-500nm处进行紫外扫描。

1.3.2.4 数据分析  试验数据为三组数据平均值，以平均值±标准偏差表示，采用Excel2013和Origin 8.0进行数据处理和分析。

2  结果讨论

2.1  肽钙鳌合率测定结果

按照上述方法测定鳌合反应液中的钙离子质量，由公式计算得胶原蛋白肽与钙离子鳌合率为50.0%±0.5%。螯合物中钙离子含量为19.7%±0.5%。

2.2  差示扫描量热分析测定结果

刘闪等[5]利用差示扫描量热法测得胶原蛋白肽的热变性温度在78.9℃，肽-钙螯合物则在112℃出现一个较强吸收峰。用差示扫描量热法测得胶原蛋白肽及肽-钙螯合物的DSC曲线如图1所示。胶原蛋白肽的吸收峰出现在73℃，说明此时胶原蛋白肽发生了热变性。而肽-钙螯合物的吸收峰出现在117℃，这可能是因为胶原蛋白肽结合钙离子后自然结构被改变，产生的新物质结构更稳定。由此可以初步推断胶原蛋白肽与钙离子发生了鳌合。

2.3  红外光谱分析结果

胶原蛋白肽和肽-钙螯合物的傅里叶红外光谱如图3所示。3400cm-1附近为-COOH中-OH的伸缩振动区域与N-H的伸缩振动区域重叠。胶原蛋白肽在此区域内的吸收峰出现在3346 cm-1处，而肽-钙螯合物的吸收峰蓝移至3421cm-1，波峰变宽，这表明肽中氨基的伸缩振动发生变化。胶原蛋白肽的红外谱图中波数位于2983 cm-1、2952 cm-1、2831 cm-1、2740 cm-1和2715 cm-1处的峰消失，此为羟基和醛基的伸缩振动区域，原因可能是螯合反应导致胶原蛋白肽内部结构改变。1633cm-1附近的吸收峰来自酰胺Ⅰ带的-c=o伸缩振动，肽-钙螯合物的该峰蓝至1650 cm-1。1560cm-1附近是酰胺Ⅱ带氨基面内变形振动，肽-钙螯合物的此峰红移至1558cm-1，表明多肽的羧基和氨基均参与了钙的配位。1400 cm-1处为羧基的特征吸收峰，肽-钙螯合物的谱图中此峰消失，说明羧基可能参与了鳌合反应。1081cm-1处为氨基的吸收峰，多肽与钙鳌合后该峰红移至1072 cm-1处，表明多肽链中的氨基与钙离子发生鳌合。

2.4  紫外吸收扫描结果

胶原蛋白肽与肽-钙鳌合物的紫外扫描光谱如图3所示。胶原蛋白肽的吸收峰在波长为200～250范围内较强，这是胶原蛋白肽的残基和肽键的特征吸收区域。胶原蛋白肽的吸收峰出现在234nm，肽-钙螯合物的吸收峰值在225nm，吸收峰发生偏移，峰的位置向短波长移动。这是由于胶原蛋白肽与钙离子鳌合后，物质中原子或者分子相互作用，发生价电子跃迁和能量级变化，最终吸收光的波长发生改变。

3  结论

酶解草鱼鱼鳞胶原蛋白所得胶原蛋白肽与钙离子鳌合，傅里叶红外光谱分析、紫外光谱分析以及差示扫描量热分析均可以支撑该结论。差示扫描量热分析显示经过鳌合反应后，物质的热变性由73℃升高到117℃，由此推断产生了一种稳定性更高的产物。比较胶原蛋白肽和肽-钙螯合物的红外光谱图发现，N-H伸缩振动发生了改变，同时波峰变宽;酰胺Ⅰ带的-c=o伸缩振动和酰胺Ⅱ带的氨基面内变形振动发生了变化，同时1081cm-1处吸收峰发生了红移，即氨基的伸缩振动发生变化。氨基参与了螯合反应。而胶原蛋白肽在1400 cm-1处羧基的特征吸收峰在肽-钙螯合物的谱图中消失，说明胶原蛋白肽中的羧基也参与了鳌合反应。紫外光谱分析结果显示，相比胶原蛋白肽的吸收峰，肽-钙螯合物的最大吸收峰向短波长处移动，说明物质吸收光的性能改变，即鳌合钙使物质的结构发生了改变。

综合以上结果，草鱼鱼鳞胶原蛋白肽与钙结合，生成了肽-钙鳌合物。

参考文献：

[1] 王诗瑶，杨 平，徐 昕，张婉悦，汤震宇，刘 影.鲤鱼鳞促钙吸收      肽的可控制备[J].现代农业研究，2018（10）：14-15.

[2] 何 云，汪有先，赵淑静，包建强.鱼骨胶原多肽螯合钙的工          艺优化[J].食品研究与开发，2018，39（21）：133-138.

[3] 高 敏，汪建明，甄灵慧，于景华，张伟伟.牛骨多肽螯合物的          制备及结构表征[J/OL].食品科学：1-11.

[4] 夏俪宁，贾 慧，李琦 ，徐 畅，董秀萍，潘锦锋.牙鲆鱼、多宝鱼         肌原纤维蛋白性质比较[J].食品工业科技，2018，39（12）：44-       48.

[5] 刘 闪，刘良忠，陈阳明，杨永生，汪海波.白鲢鱼骨胶原低聚         肽螯合钙的结构表征及其促细胞增殖作用[J].中国食品学      报，2016，16（09）：185-191.

[6] 周亚丽. 魔芋ACE抑制肽分離纯化及体外降血压活性研        究[D].陕西科技大学，2017.

[7] 申勇涛，原 恺，霍乃蕊，程稚玲，韩克光，范 华，樊玮鑫.高钙含      量肽钙螯合物的制备与表征分析[J].山西农业大学学报           （自然科学版），2018，38（05）：50-56.

[8] 王 洋，郭耀华，樊晓盼，熊凤娇，王凯丽，马俪珍，焦学超.鲶鱼       骨肉泥酶解多肽螯合钙的结构表征[J].食品工业科技，             2018，39（13）：36-40.