食源性微生物的分子检测方法

张雪颖

（1.苏州大学 江苏苏州 215123；2.剑桥-苏大基因组资源中心）

1 前言

食源性病原微生物和腐败有机体的生长对公共卫生和食品工业都构成了巨大的威胁。为了确保食品微生物的安全性和质量，需要有效的检测方法监测原材料、食品加工环境和最终产品中的污染物。食品工业采用传统的微生物检测方法观察人工培养基中细菌细胞的物理生长。但传统方法费时费力，通常情况下最初的结果交付需要2～3 d，最终确认需要10 d，这显然给许多工业应用带来了不便，特别是在当今的全球分销市场上。分子技术的最新进展使检测和鉴别比传统的方法更快、更方便、更灵敏、更特异。

分子检测技术是基于对核酸的识别和扩增。在过去的十几年中，许多生物在公共领域获得了大量的遗传信息，为基于DNA/RNA的测试提供了有力地支持[1]。这些检测方法很好地替代了传统的培养方法。聚合酶链式反应 （PCR）和核酸序列扩增(NASBA)等方法为快速、特异、敏感地检测食品中的微生物污染提供了很大的优势。此外，使用微阵列可以在一次检测中同时检测和鉴定多种病原体和基因。

2 荧光原位杂交

荧光原位杂交技术是利用特异性寡核苷酸探针直接从临床、食品和环境样品中检测和鉴定特定微生物的方法。检测时，用适当的化学固定剂处理微生物细胞，并用寡核苷酸探针固定在载玻片上或溶液中。在严格洗涤以除去未结合的探针后，染色的细胞通过荧光显微镜被检测到。荧光原位杂交技术特异性的关键是从靶细菌中选择一种独特的寡核苷酸片段作为探针。毒力基因经常被用作探测目标来检测食源性病原体，因为它们通常在特定组中是保守的。通过使用核糖体RNA作为靶标，大大提高了荧光原位杂交检测的灵敏度[2]。

3 常规PCR

PCR是由Kary Mullis于1983发明的一种DNA片段扩增技术,可以将一些拷贝的靶DNA扩增至数千到数百万拷贝的特定DNA序列。在微生物诊断PCR中，使用特异性引物扩增目标DNA片段。扩增产物的存在表明测试样本中存在微生物。常规PCR方法在琼脂糖凝胶上用电泳和溴化乙锭染色法显示扩增产物。有时为了进一步确认，需要进行Southern印迹等分析，用来区分真正的放大分子和非特定的最终产品。自出现以来，PCR被认为是分子生物学领域最重要的研究成果。PCR具有特异性、敏感性、快速性和准确性等优点。然而，常规PCR进行食品微生物检测时存在若干缺陷：首先，由于低水平的污染病原体或抑制酶反应的残留食物成分可能获得假阴性结果；其次，仅存在于实验室中的偶然DNA的非特异性扩增或来自于死亡细胞的DNA碎片可导致假阳性检测[3]；最后，传统的PCR不能充分量化，食品行业对PCR的需求也在不断增长。

4 实时PCR

实时PCR技术的发展是PCR检测技术的重大进步。实时PCR在每个复制周期中都包含荧光探针，从而使用光学模块进行监测。它可以快速、动态地评估PCR扩增产物，减少外来核酸的污染。SYBR Green、分子信标和Taqman探针是3种主要的实时PCR形式。

SYBR Green是一种高度特异性的双链DNA结合染料，当它被添加到PCR产物中时，会嵌入双链扩增产物中。SYBR Green实时PCR是所有实时PCR检测中最经济、最简单的选择。然而，所有双链核酸片段，包括引物二聚体，都能与SYBR Green结合并产生荧光信号[4]。

分子信标实时检测采用单链寡核苷酸探针检测扩增产物。该探针形成茎-环发夹结构，并用荧光团和猝灭剂标记。环路序列与扩增产物互补，通过退火位于探针序列任一侧的互补臂序列形成茎。分子信标的发夹结构是封闭的。将信标环与扩增产物杂交迫使茎区开放，诱导检测到的荧光信号。如果没有扩增产物，则茎保持闭合且猝灭剂组分吸收荧光信号[5]。

在Taqman实时PCR中，用5’荧光报告染料和3’猝灭染料标记探针进行信号检测。最初，探针与模板退火，由报告染料发射的荧光信号被附近的猝灭染料吸收。随着扩增过程的进行，寡聚探针的互补序列被聚合酶的5’外切酶活性酶解，而游离的报告染料发出信号。猝灭染料距离太远，无法吸收荧光信号，使来自报告染料的信号被光学模块捕获。

实时PCR系统，特别是Taqman实时PCR是检测食品样品中细菌、真菌和病毒污染的领先技术。通过将PCR最终产物与寡核苷酸探针杂交，实时PCR提供了较高的速度和特异性。实时PCR还可以获得具有有限操作和扩增产物污染的结果。利用不同的引物和探针组合，实时PCR能够同时识别同一反应中的多种生物或多种基因。此外，实时PCR结果是定量的。模板DNA拷贝数可以确定，因为相对荧光单位(CT值)记录在每个放大周期。然而，如上所述，实时PCR的主要限制之一是无法区分活细胞和非活细胞。

5 DNA微阵列

DNA微阵列是排列有数千个寡核苷酸点或cDNA探针的玻璃或硅芯片。待分析的靶DNA分子与阵列上的识别探针杂交。由阵列上的绑定目标生成的信号允许基于探针的已知信息进行识别。该技术可以允许单个小阵列测定中平行鉴定和表征以千计的寡核苷酸。一般而言，DNA微阵列实验设计和典型的步骤包括：（1）寡核苷酸探针合成；（2）阵列制备；（3）样品制备；（4）检测杂交；（5）扫描和检测；（6）数据分析[6]。

对于食品微生物分析，寡核苷酸芯片为多种毒力基因提供了高通量分析，同时检测多种食源性致病菌。用于食品微生物分析的芯片初始应用由食品药品监督局（FDA）完成，在各种毒力因子的基础上鉴定肠道食品病原体。近年来，DNA微阵列技术已被用于检测单个或多种病原体，如李斯特菌、金黄色葡萄球菌、空肠弯曲菌、志贺菌、大肠杆菌和沙门菌。一般来说，核糖体RNA编码基因和各种毒力基因用于细菌鉴定。通常，扩增靶生物体的特定片段，然后通过杂交微阵列进行鉴定。PCR扩增最初用于提高检测灵敏度和降低非特异性背景DNA的噪声，从而使复杂样品中的低计数病原体细胞得以检测[7]。

微阵列需要昂贵的设备，且对病原体的计数也很有限。然而，微阵列是快速的、特异性的，具有高样品体积，并能同时检测多种病原体。基于微阵列的检测方法的优势使其优于许多技术，成为食品微生物检测的潜力股。

6 食源性微生物的分子检测方法的局限性

与常规培养和免疫技术相比，分子检测方法具有明显缩短检测时间的优势。它们还提供半定量信息，并确保敏感检测复杂食品基质中的特定目标。尽管有这些优点，分子方法在食品分析中的应用是有限的。一个原因是残留食物成分的干扰和食品样品中常见的低水平污染物产生的假阴性[8]。例如，之前在牛奶中的研究已经证明了分子检测方法的局限性：牛奶中存在的蛋白酶抑制了降解Taq聚合酶的PCR；钙离子通过改变反应的缓冲能力阻碍了扩增。通过使用内部阳性对（IPC）可以发现扩增抑制剂的存在。IPC是精确已知量的核酸片段，其被添加到反应中并与靶序列共同扩增。如果没有信号或微弱的放大信号由IPC产生，则可以抑制和检测效率。

如上所述，分子检测方法的缺点是靶向DNA分子不能区分活细胞和非活细胞。这在食品安全和质量控制中尤为重要，因为只有活细胞才有可能构成潜在风险。当前亟需适当的新方法或对已知分子方法的改进对食品中的活细胞进行快速检测。