CD163 与猪繁殖与呼吸综合征病毒研究进展

李树斌 张雅璇 王春雨 任敬宇 戴雁峰

（内蒙古大学生命科学学院， 内蒙古呼和浩特 010021）

1987—1996 年，由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV） 感染、侵袭引发的猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS，又称猪蓝耳病）在美国全面暴发，随后该疾病陆续传播至北美、欧洲等各个国家和地区，妊娠母猪感染该病后表现为母猪流产率显著增加36.4%，死胎率显著增加6.6%，而新生仔猪存活率降低6.7%，哺乳期仔猪的存活率减少30.7%，同时，仔猪肺炎严重，生长速度剧烈下降[1]。

从1996 年我国发现首例猪蓝耳病开始，至今已有30 余年，蓝耳病反复发作严重阻滞了我国生猪养殖业的发展。近年来我国出现的高致病性猪蓝耳病进一步对我国生猪养殖业造成了致命打击，而且我国的养猪企业存在猪群密集、流动频繁等情况，进一步扩大了感染范围，由于目前商业化的疫苗只能提供部分保护，因此蓝耳病的迅速传播严重损害了养殖户的经济效益，基于PRRSV 入侵机体的机理研发对应的抗体，提升我国生猪对PRRSV 的抵抗力对保障我国生猪养殖业的发展至关重要。

1 PRRSV 结构及其感染过程

1.1 PRRSV 及基因组结构

PRRSV 与马动脉炎病毒（Equine arteritis virus,EAV）、小鼠乳酸脱氢酶病毒（Lactate dehydrogenase elevating virus,LDV）以及猴出血热病毒（Simian hemorrhagic fever virus,SHFV）等病毒均隶属于尼多病毒目（Nidovirales）动脉炎病毒科（Arteriviridae）动脉炎病毒属的主要成员。在电子显微镜下观测，PRRSV 的直径为50～60 nm，呈球形或椭圆形颗粒，具有相对光滑的外观，PRRSV 的核衣壳直径为25～35 nm，呈20 面立体对称结构，具有电子致密性，同时，核衣壳表面有约5 nm 的突起结构，其外围被一层脂质双层膜围绕[2]。

作为不分节段的单股、正链RNA 病毒，PRRSV 的基因组RNA 长度约为15 kb，在其5’端处存在帽子结构（5’-Cap），而3’端具有多聚腺嘌呤核苷酸尾巴结构（3’-polyA），目前的研究报道指出，在病毒复制过程中，3’端的结构域可能是RNA 聚合酶结合的关键区域之一。

PRRSV 基因组结构中含有9 个开放阅读框（open reading frame, ORFs）， 分 别 为 ORF1a、 ORF1b、ORF2a、 ORF2b、 ORF3、 ORF4、 ORF5、 ORF6 及ORF7，以上每个阅读框之间都与其相邻的阅读框之间存在部分的碱基重叠区域，重叠序列结构为5’-ORF1a和ORF1b-ORF(2-6)ORF7-3’端。

ORF1（ORF1a 与ORF1b 之间存在16 个重叠的核苷酸） 长度约为12 kb，占整个基因组全长的80%。ORF1 阅读框位于PRRSV 基因组5’端的非编码前导序列（211 个碱基）之后，其主要功能是编码部分高度保守的非结构蛋白以及RNA 聚合酶或合成酶等蛋白，在ORF1a 编码区中存在丝氨酸蛋白酶区和富含半胱氨酸区的疏水区域，而ORF1b 的序列中存在4 个特异区域，即聚合酶元序列区域、蜗牛酶元序列区域、富含半胱氨酸和组氨酸的锌指区域及目前功能尚未明确的保守区域。在ORF1a 和ORF1b 的重叠区存在7 个核苷酸结构（UUUAAAC）和形成RNA 拟节序列，这2 种序列（结构）进一步参与调控RNA 聚合酶翻译过程中的核糖体移码。

ORF2～ORF7 分布在PRRSV 基因组的约3.5 kb 3’端，ORF7 终止密码子后为114 个碱基的非编码区和仅20 个碱基的3’-poly（A）尾巴序列。ORF2～ORF7 主要的生物学功能是负责编码病毒中的结构蛋白，如囊膜糖蛋白（如GP5 蛋白）、基质蛋白（M 蛋白）及核衣壳蛋白（N 蛋白）等。由ORF6 编码的M 蛋白和由ORF7编码的N 蛋白为PRRSV 结构中的优势结构蛋白，其氨基酸序列相对保守，目前已被用于疾病诊断的靶抗原[2-4]。

1.2 PRRSV 分型

根据PRRSV 的抗原性、基因组及致病性等特性，目前可将PRRSV 分为2 个主要亚型，即欧洲型（主要以LV 株为代表株）和美洲型（主要以ATCC-VR2332株为代表株）[5,6]，基因组学和遗传学相关研究结果表明，PRRSV 在RNA 合成过程中极易发生RNA 基因组的点突变、碱基缺失、添加和取代等过程，从而导致PRRSV的突变频率极高，而且大量针对不同地区PRRSV 的序列分析结果进一步证实PRRSV 欧洲型和美洲型之间的确存在极大的序列差异性，其核苷酸的同源性仅为55%～70%。

PRRSV 的欧洲型与美洲型毒株中5’UTR 和3’UTR 的序列差异非常显著，其同源性显著低于50%。在欧洲型毒株的5’UTR 结构域中存在221～223 个核苷酸，而在美洲型毒株中，序列相对保守的5’UTR 结构域中存在189～190 个核苷酸，仅存在个别碱基的置换或缺失情况。与欧洲型毒株相比，美洲型毒株的3’UTR 序列更长，2 种毒株3’UTR 碱基序列的同源性显著低于60%，此外，2 种毒株的polyA 数量间的差异性进一步影响了PRRSV 的复制过程。

通过深入分析、比对欧、美型毒株的序列的差异，结果表明欧、美型毒株之间，ORF1 序列的差异性较大，而ORF1 序列的差异性主要是由ORFla 序列的差异性所决定，分析原因认为，Nsp1β 及Nsp2 等非保守氨基酸的差异性决定了欧、美型毒株之间的差异性。作为欧、美型毒株间变异最大的编码区域之一，Nsp2 具有种间特异性，其生物学功能是参与调控PRRSV 对细胞或组织的嗜性。有研究报道指出，Nsp2 的活性与PRRSV 毒株的致病性密切相关。

1.3 PRRSV 感染猪的过程

在PRRSV 感染猪群的过程中，该病毒可以通过环境应激、垂直传播及水平传播等途径进入病猪鼻腔中，粘附后破坏鼻腔黏膜组织及纤毛结构，进一步导致纤毛失去其原有生理功能，不能有效地过滤病毒入侵；随着PRRSV 入侵咽喉及支气管腔，病毒进一步定植于支气管腔上皮细胞处，快速引发猪咳嗽及大喘气；随着感染的深入，PRRSV 进一步降低了猪对支原体等病原的抵抗性，导致了鼻腔内纤毛的大量脱落及纤毛上皮细胞的急性损伤，同时抑制了纤毛的摆动，导致纤毛丧失其甩动黏液的功能。

在支原体等抗原的催化作用下，PRRSV 可特异性地与细胞表面的CD151 分子、CD163 分子、硫酸乙酰肝素（Heparan sulfate, HS）、唾液酸粘附素（Sialoadhesin, Sn）以及波形蛋白（Vimentin）等受体进行特异性结合，促进自身经胞吞作用进入猪肺泡巨噬细胞（porcine alveolar macrophage），并在肺泡巨噬细胞中快速扩增，进而导致肺泡巨噬细胞的破裂、溶解以及肺泡巨噬细胞数量显著下降，从而抑制猪肺泡的正常生理功能，并引发机体产生免疫抑制。肺泡巨噬细胞的破裂导致PRRSV 进一步随着血液循环系统和淋巴系统扩散至全身，并进一步在血液巨噬细胞和单核细胞中快速扩繁，进一步引发全身性败血症状、淋巴肿大及相应肺脏器官损伤等，严重时导致猪个体死亡[4,7-9]。研究发现，以上这些受体中CD163 是PRRSV 感染宿主细胞的必需受体。

2 CD163 与PRRSV 感染的相关性研究

在机体的免疫过程中，巨噬细胞起着关键的调控作用，其机理与成熟的巨噬细胞和它的前体——单核细胞密切相关，上述2 类细胞在机体免疫过程中形成高度特异化的细胞亚群，密切参与机体的免疫过程。巨噬细胞亚群的生物学功能主要取决于巨噬细胞表面的不同特异性受体，如补体受体（Complement receptor）、清道夫受体（scavenger receptor）、Fc 受体（The Fc receptor）、生长因子、粘附分子和可溶性介质受体等。其中，包括了胶原型受体、C 型外源凝集素受体、富含亮氨酸或半胱氨酸重复序列型受体等成员的清道夫受体家族功能基本相似，但其结构多种多样，按照其结构特性，可将清道夫受体家族进一步依次划分为8 个类型（A-H）。

CD163 作为富半胱氨酸清道夫受体（scavenger receptor cysteine-rich domain, SRCR） 超家族的主要成员之一，其I 型跨膜蛋白结构域是PRRSV 感染细胞必需的结构，而且不同动物之间跨膜域的蛋白序列也具有良好的保守性，其生物学功能与受体分子与细胞膜的锚定过程密切相关。

2.1 CD163 结构和功能

CD163 蛋白的分子量约为130 kDa，由胞外区、跨膜区和胞内区3 部分组成，CD163 的胞外区是由9 个重复的SRCR（scavenger receptor cysteine rich）结构域和2 个脯氨酸—丝氨酸—苏氨酸富集结构域（PST）构成的。CD163 中的每个SRCR 结构域均由100～110 个氨基酸残基构成，需要指出的是除第8 个SRCR 结构域中存在6 个半胱氨酸残基外，其余的SRCR 结构域均只含有8 个半胱氨酸残基[10]。

早期研究结果表明，CD163 可作为有核红细胞的附着受体，密切参与调节体内红细胞的生成过程。随着研究的深入，研究者们发现表达CD163 蛋白的巨噬细胞具有清除血液中血红素的作用，在该过程中，CD163 蛋白质的第3 个富含半胱氨酸结构域暴露于巨噬细胞表面，在Ca2+和pH 值的调控下，该结构域可特异性地结合血红素—结合珠蛋白（hemoglobin haptoglobin complex, Hb-Hp）复合体，随后将其运输至早期细胞内体中，之后，CD163 迅速脱离复合体，重新转移到巨噬细胞的细胞膜表面，而Hb-Hp 复合物则在溶酶体中被进一步水解。因此，CD163 介导的细胞内吞作用可以快速清除细胞周围的Hb-Hp 复合物，从而使组织或细胞不受Hb 引发的氧化损伤等不利情况。另外，CD163与Hb-Hp 复合物的特异性结合可进一步激活如IL-10、Fe2+、CO 和胆红素等炎症相关因子的释放。

此外，CD163 在人和小鼠的单核细胞/巨噬细胞表面特异性表达，而且密切参与巨噬细胞的分化过程[11]。CD163 的表达水平受促炎信号和抑炎信号调控，并在免疫应答过程中发挥着重要的作用。目前在临床血液和体液中均可检测到可溶性CD163（soluble CD163,sCD163）的表达，这种由CD163 胞外结构域构成的复合物可在临床上作为单独的生物标记物。可溶性的CD163 和跨膜的CD163 分子均具有很强的抗炎症作用，但只有可溶性的CD163 分子对T 细胞的增殖有抑制作用[11]。同时，CD163 还是PRRSV 和SHFV11 等病毒感染过程中的关键受体。

2.2 CD163 在PRRSV 入侵过程中的作用

在猪体内，PRRSV 主要感染猪肺泡巨噬细胞（Porcine alveolar macrophage, PAM）。研究人员在对PAM 细胞的cDNA 表达文库筛选时发现，在细胞中过表达CD163 蛋白后，可以将PRRSV 非易感细胞系转变为PRRSV 易感细胞系。如在PAM 细胞系3D4/21（把SV40 的大T 抗原转入已构建的永生化细胞系）中，发现该永生细胞系并不能感染PRRSV，并且在这个细胞系中并没有检测到CD163 分子的表达水平[12]，但在永生化细胞系中对CD163 进行过表达则导致细胞系容易感染PRRSV，细胞系中高表达CD163 后，PRRSV 对细胞系的感染能力急剧增加，而且细胞内产生的病毒滴度显著高于MARC-145 细胞感染PRRSV 后产生的病毒滴度。

同时，在不能感染PRRSV 的细胞系（LLC-PK1、PK-0809、BHK-21 和NLFK 细胞系） 中对CD163 进行过表达，可以使这些细胞系易被PRRSV 感染并产生高滴度的病毒颗粒，而且在自然状态下，Dulac 细胞（PK15 细胞亚系）和PK15 细胞均无法感染PRRSV，但过表达CD163 分子后却能使上述2 种细胞系易被PRRSV 感染。

Genus Plc 公司和美国密苏里大学在2016 年合作，利用最新的CRISPR-Cas9 技术培育出了CD163 基因缺失的基因编辑猪，系列攻毒试验结果表明，CD163 基因缺失猪不能被PRRSV 感染，这个关键性的成果进一步表明CD163 是PRRSV 感染猪宿主必需的受体[13]。

尽管在上述非易感PRRSV 细胞系中瞬时过表达CD163 分子能够使其转变为易感PRRSV 细胞系，但内化的病毒粒子水平极低，而且PRRSV 只在部分细胞中表现出数量的上调[14]，这表明CD163 在PRRSV 的内化过程中并不是起着关键的作用。将抗CD163 的单克隆抗体与PAM 细胞系一起在37℃下孵育，发现PAM 细胞中的PRRSV 感染水平被显著性抑制，但在4℃条件下用同样的抗体和细胞进行孵育，发现PAM 细胞中PRRSV的感染水平无显著变化，上述试验结果说明CD163 在调控PRRSV 的感染过程中，主要参与的是病毒内吞和脱壳，而非吸附或内化过程。

3 小结

综上所述，CD163 在单核细胞/巨噬细胞表面特异性表达，是PRRSV 入侵细胞时的必需受体，该分子既可以结合PRRSV 颗粒，还密切参与调控病毒RNA 在宿主细胞内复制的过程[15]。有学者发现，在PRRSV 感染宿主细胞及猪发病的过程中，CD163 不仅能促进病毒的内吞及外壳的脱落，还在基因组RNA 释放到宿主细胞胞质的过程中起着重要的调控作用，因此，进一步了解PRRSV 与CD163 的特征及关系有助于有效防治猪的PRRS。