高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱对水产品中未知污染物的非定向快速筛查与测定

郭思言, 丁 涛, 殷 耀, 张晓燕, 柳 菡, 沈伟健,林 宏, 吴 斌, 邓晓军, 伊雄海, 杨功俊

(1. 南京海关动植物与食品检测中心, 江苏 南京 210019; 2. 中国药科大学药学院, 江苏 南京 211198;3. 上海海关动植物与食品检验检疫技术中心, 上海 200135)

我国是世界上最大的水产品生产国之一,国内市场供应丰富,国人对于水产品的需求也呈增长趋势[1,2],水产品的安全性因此成为食品领域关注的焦点[3]。此前,原国家食品药品监督管理总局在2017年两次对全国经营环节重点水产品进行专项检查和抽样检验,检出孔雀石绿、硝基呋喃代谢物、氯霉素和喹诺酮类等药物残留,不合格率达到9.5%～10.9%[4,5]。已有科学工作者就致病微生物、病毒、养殖与加工过程中渔药的非法投入、甲醛及重金属等不同危害来源进行了水产品领域的风险监测[6],但国内对水产品中其他品种环境污染物监测覆盖率不高。污染物通常指农药类、持久性有机污染物(persistent organic pollutants, POPs)和药物及个人护理品(pharmaceutical and personal care products, PPCPs)等,主要由周围环境带入,因具有复杂和不确定性使水产品质量安全受到的威胁难以预测[7-9]。高分辨质谱因其扫描范围宽,测定灵敏度高,结合相关数据库可实现对未知化合物的定性被广泛用于非定向筛查分析[10,11]。四极杆/静电场轨道阱质谱作为高分辨质谱的一种,分辨率可达十万,在无标准品及短时间内无法对分析物进行条件优化的情况下,通过准确测定分子离子峰的精确质量数、化合物同位素丰度比及二级碎片特征离子信息与基础数据库检索匹配,实现大量数据的高通量分析,从而完成对样品中药物残留的定性筛查[12]。因此,选择高灵敏度、高准确性的高分辨质谱对水产品中含量较低的环境污染物进行非定向筛查分析较为合适。国外有相关研究证明水产品中已检测到多溴联苯、多氯联苯及有机氯农药在鱼体内的聚集[13], Chiesa等[14]利用气相色谱-串联质谱法研究并测定了野生金枪鱼中持久性污染物的含量,发现部分金枪鱼中含有POPs,虽然没有明确的毒性,但经过长时间生物积累,有可能会大量聚集在生物体中,对食品安全造成威胁。Nacher-Mestre等[15]利用气相色谱-飞行时间质谱仪进行筛查发现毒死蜱、嘧啶磷在一些植物性饲料中检出,而乙氧基喹啉在动物饲料和鱼中检出,但作者未对其含量进行测定。

本研究利用静电场轨道阱高分辨质谱,通过采集样品全息离子扫描-数据依赖二级离子扫描数据图,结合含有1 729种环境污染物的数据库对405个水产样品中的环境污染物残留进行高通量非定向筛查分析,样品中除筛查出孔雀石绿、硝基呋喃代谢物、氯霉素和喹诺酮类等药物残留外,对未在我国水产品中要求相关限量的污染物三环唑、乙氧基喹啉和咖啡因进一步优化其样品前处理条件,并进行定量。

1 实验部分

1.1 标准品、试剂、材料和样品

三环唑(tricyclazole)、乙氧基喹啉(ethoxyquin)、吗菌灵(dodemorph)、氯吡脲(forchlorfenuron)、高灭磷(acephate)、二丙烯草胺(allidochlor)、噻嗪酮(buprofezin)、卡巴呋喃(cabofuran)、绿麦隆(chlortoluron)、二苯胺(diphenylamine)购自Sigma公司,纯度≥95%;咖啡因(caffeine)、速灭威(metolcarb)购自Dr. Ehrenstorfer公司,纯度≥95%。乙腈(色谱纯)购自德国Merck公司;甲酸(色谱纯)购自美国Tedia公司;无水硫酸镁(分析纯)购自南京化学试剂一厂;十八烷基硅烷粉(C18, 40～60目)和N-丙基乙二胺粉(primary secondary amine, PSA, 40～60目)购自美国Sepax-UCT公司;氯化钠(分析纯)购自南京化学试剂股份有限公司;石墨化炭黑(Carb-GCB)购自深圳逗点生物技术有限公司;Envi-Carb串联PSA柱(500 mg/500 mg/6 mL)购自美国Supelco公司;水产样品来自江苏省水产批发和零售市场。

标准品用甲醇溶解配制成1 000 mg/L母液,4 ℃冰箱避光保存。根据实际需要稀释成不同浓度的标准工作液。

1.2 仪器设备

Dionex 3000高压液相色谱、Thermo Scientific Q Exactive高分辨质谱仪带Trace Finder处理软件(美国Thermo Fisher Scientific公司); ELGA-Q15高纯水发生器(英国ELGA公司);涡旋混合器(北京来普特科学仪器有限公司)。

1.3 样品前处理

1.3.1筛查分析通用前处理

称取5 g(精确到0.01 g)水产样品于50 mL具塞离心管中,加入10 mL乙腈,涡旋混匀3 min,超声提取10 min,在8 000 r/min下离心3 min,取上清液于40 ℃水浴下氮气吹干。加入1 mL甲醇-水(3∶7, v/v)涡旋30 s,过0.22 μm滤膜后供仪器分析。

1.3.2定量分析前处理

称取2 g(精确到0.01 g)水产样品于50 mL具塞离心管中,加入10 mL乙腈、4 g无水硫酸镁、10 g氯化钠置于涡旋混合器涡旋5 min,使样品充分盐析,超声提取10 min, 8 000 r/min下离心3 min,转移上清液至10 mL试管中,于40 ℃水浴中氮气吹干。加入0.5 mL甲醇涡旋混匀,溶液转移至1.5 mL离心管,加入水0.5 mL、PSA 50 mg、C1820 mg,以12 000 r/min离心3 min,过0.22 μm滤膜后供仪器分析。

1.4 仪器条件

1.4.1色谱条件

色谱柱:Phenomenex Kinetex C18色谱柱(100 mm×4.6 mm, 2.6 μm);流动相A为甲醇,流动相B为0.1%(v/v)甲酸水溶液;梯度洗脱程序:0～1.0 min, 10%A; 1.0～3.0 min, 10%A～40%A; 3.0～5.5 min, 40%A～95%A; 5.5～9.5 min, 95%A; 9.5～10.0 min, 95%A～10%A; 10.0～12.0 min, 10%A,流速:0.50 mL/min;柱温:室温;进样体积:10 μL;分析时间:12 min。

1.4.2质谱条件

非定向筛查质谱条件 可加热电喷雾离子(HESI)源,正负离子切换模式;检测方式:全扫描数据依赖二级扫描(full MS-ddMS2);毛细管加热温度:320 ℃;鞘气(N2)流速:40 L/min;辅助气(N2)流速:10 L/min;吹扫气(N2)流速:3 L/min;喷雾电压:3 kV; Full MS扫描分辨率(R): 70 000;自动增益控制(AGC target): 3×106;最大驻留时间: 100 ms;扫描范围:m/z100～1 500;阈值触发值:1×105;顶点触发时间: 2～8 s;动态排除时间:10 s; ddMS2扫描分辨率(R): 17 500;自动增益控制:1×105;最大驻留时间:50 ms; Top N: 5;分离窗口:m/z4.0;碰撞能量:40 eV;碰撞能量步进值:50%。

定量分析质谱条件 HESI源,正离子模式;检测方式:目标离子二级扫描(target-MS2);毛细管加热温度:320 ℃;鞘气(N2)流速:40 L/min;辅助气(N2)流速:10 L/min;吹扫气(N2)流速:3 L/min;喷雾电压:3 kV;分辨率(R): 17 500;自动增益控制:2×105;最大驻留时间:100 ms。

1.4.3筛查方法

通过full MS-ddMS2模式和Trace Finder软件对从实际样品中采集到的数据进行筛查分析,检索参数为:母离子精确质量数偏差为1×10-5,峰阈值强度为1×104,信噪比(S/N)为5,子离子精确质量偏差为1×10-5,匹配最少碎片个数为2,同位素丰度相似度为90%,同位素精确质量数偏差为1×10-5,在包含1 729种环境污染物的数据库中检索,筛查过程中全部符合以上设置条件的化合物为初筛通过。初筛通过的化合物采用Library Manager进行二级谱图库对比,二级离子质量数偏差为1×10-5,保留时间限定为±0.5 min,相似度大于0.7视为确证。

2 结果与讨论

2.1 筛查方法的确立

为保证所建立的筛查方法在样品通用前处理过程、整个质谱数据采集过程及筛查分析过程的精密度和准确性,本实验选取8种具有极性和保留时间差异的农药污染物(吗菌灵、氯吡脲、高灭磷、二丙烯草胺、噻嗪酮、卡巴呋喃、绿麦隆、二苯胺)作为质控化合物对整个筛查过程进行监测。选择空白水产样品添加0.05 μg/g水平的上述8种混合标准溶液作为监测样品,采用筛查过程所用前处理方法,按实验中的色谱-质谱条件选择含有1 729种污染物的数据库进行匹配分析,对母离子精确质量数偏差、子离子精确质量数偏差、同位素丰度等条件进行优化,为保证上述8种化合物均能通过数据库匹配,优化后设置的母离子及子离子精确质量数偏差1×10-5,同位素丰度相似度90%。进样时将监测样品一同分析,保证筛查过程的有效性。8种农药污染物的提取离子流图见图1。

图 1 8种农药污染物的提取离子色谱图Fig. 1 Extracted ion chromatograms of eight pesticide pollutants

本实验通过对405个水产样品应用1 729种环境污染物的数据库进行初步筛查,结果表明样品中存在我国未要求限量的风险化合物三环唑、乙氧基喹啉、咖啡因和速灭威。

2.2 定性分析

药物非定向筛查基于高分辨数据库,高分辨数据库集储存化合物多方位信息和化合物归类一体化。实验将待筛查项目中涉及的所有化合物信息导入数据库,构成一个专属性强的项目数据库。数据库所包含的信息:化合物名称、结构式、分子式、精确质量数、美国化学文摘登记号(Chemical Abstracts Service)、离子化方式、分类、保留时间及碎片离子精确质量数信息等;此外,与高分辨数据库结合进行化合物信息确证的Library Manager软件有二级碎片离子谱图储存功能,可储存化合物在一定碰撞能下的二级质谱图,用于二级谱图相似度检索比对,为化合物定性确证提供更有利的匹配条件,减少假阳性。在筛查分析时根据需要进行条件设置,可提高筛查结果的准确性。但谱图库的数据量较大,过程建立复杂,需要的存储空间较大。本实验先进行基于高分辨数据库的二级碎片筛查分析,对于筛查过程中发现的风险化合物三环唑、咖啡因、乙氧基喹啉和速灭威,将其与标准品的高分辨二级碎片谱图数据库进行二级离子碎片相似度较,通过优化精确质量数偏差、对比与标准品保留时间的差值进一步提高筛查结果的准确性,最终确定实际分析中二级离子质量数偏差为1×10-5,保留时间差限定为±0.5 min,相似度大于0.7。图2为样品中检出化合物与标准品的二级谱图碎片定性确认对比图,样品中筛查出的三环唑、咖啡因、乙氧基喹啉与实际标准品保留时间差小于0.5 min,并且谱图相似度在0.75～0.95之间,定性通过,可进一步进行定量分析。由于速灭威标准品与实际水产样品中筛查出的化合物保留时间差为3 min,谱图相似度在0.44～0.54之间,故定性失败,因此,最终确定样品中含有三环唑、咖啡因和乙氧基喹啉。

图 2 阳性样品与标准品的二级碎片离子对比图Fig. 2 Comparison of fragment ion mass spectra between positive samples and standards

2.3 定量分析条件的优化和方法学验证

无净化步骤的通用前处理过程可避免化合物的漏检,但因存在基质效应干扰较大,检测灵敏度低[16]。水产品中含有蛋白质和脂肪,基质成分较复杂[17],直接提取条件下8种作为质控的农药回收率为40%～70%。需要优化前处理过程对阳性样品中筛出的化合物进行准确定量。

相比于甲醇和乙酸乙酯,乙腈沉淀蛋白质的效果较好,对三环唑、咖啡因、乙氧基喹啉这3种化合物的提取效率较高,因此前处理采用乙腈提取。比较了固相萃取柱和QuEChERS方法对前处理过程的净化效果。结果表明,Envi-Carb串联PSA柱的净化效果一般且费时,QuEChERS法处理快速且除脂效果较好。分别对除水剂和净化剂的选择进行优化,选取无水硫酸镁作为除水剂时各化合物的回收率均较高,C18和PSA作为净化剂可去除大部分脂质,石墨化炭黑加入后对部分含苯环化合物有一定的吸附作用,回收率偏低,其主要用于去除色素[18],而水产品中色素含量较少,因此选择C18和PSA对样品进行净化。

质谱分析采用电喷雾正离子源,分别将质量浓度为1 000 μg/L的三环唑、乙氧基喹啉、咖啡因标准溶液进行一级质谱全扫描,选择各化合物的分子离子优化碰撞能量并选择干扰较少的子离子分别作为定性定量离子,见表1。配制质量浓度范围为5～1 000 μg/L的混合标准溶液,以各物质的质量浓度(x, μg/L)为横坐标,对应的峰面积(y)为纵坐标建立标准曲线,3种化合物在5～1000 μg/L范围内线性关系良好,r2均大于0.99。3种化合物的检出限(LOD)均为1 μg/kg,定量限(LOQ)均为5 μg/kg。分别在鱼肉、虾肉样品中进行5、10、20 μg/kg 3个水平的加标回收试验,3个添加水平下各化合物的平均回收率及精密度见表2。

表 1 3种化合物的质谱检测参数Table 1 MS parameters of three compounds

*Quantitative ion.

表 2 3种环境污染物在鱼、虾样品中的加标回收率和 精密度(n=6)Table 2 Recoveries and RSDs of the three environmental pollutants spiked in fish and shrimp samples (n=6)

2.4 定量分析与定性分析结果比较

将三环唑、咖啡因、乙氧基喹啉3种化合物在阳性样品中的定量分析结果与定性结果进行比较发现:通过筛查方法定性确认的3种化合物在进行阳性样品定量时也均分别检出三环唑、咖啡因、乙氧基喹啉,且这3种化合物定量时采用的定性及定量离子均在筛查方法选用的子离子中,样品与标准品的离子丰度比匹配度达80%以上。说明定性筛查方法准确,对于筛查通过的化合物可进行进一步的定量分析。

2.5 实际样品的检测结果及分析

利用建立的初筛方法对405个水产样品进行高通量筛查定性分析,样品包括鲫鱼、鳜鱼、黑鱼、草鱼、罗氏沼虾、罗非鱼、肉蟹、对虾等品种,通过初步筛查确认样品中存在三环唑、咖啡因、乙氧基喹啉3种污染物。采用优化后的条件对阳性样品进行三环唑、咖啡因、乙氧基喹啉的定量分析,结果表明,样品中三环唑的检出率为1.2%,含量范围在10.1～16.5 μg/kg;咖啡因检出率为1.7%,含量范围在5.2～5.8 μg/kg;乙氧基喹啉检出率为1.2%,含量范围在8.4～12.1 μg/kg。对结果进行分析,其中三环唑为农药污染物,推测是由于不规范使用农药带来的水源或农作物污染,进而富集到水产品中[19];咖啡因是一种优势污染物,在国内湖泊及地表水中均有检出,其常在咖啡、茶、巧克力及可乐型饮料中用作兴奋剂、苦味剂和香料;此外咖啡因也是一种重要的解热镇痛药,复方阿司匹林的主要成分之一,在当今社会使用非常广泛[20,21],因此水产品检出咖啡因可能是由于水体污染造成的;乙氧基喹啉作为抗氧化剂常在饲料或渔用药物中投入使用。目前GB 2763-2016中制定了三环唑在稻谷和蔬菜中的最大残留限量为2 mg/kg,水果中乙氧基喹啉的最大残留限量为3 mg/kg[20],水产品中均无相关要求。水产品中农药限量仅滴滴涕和六六六两项[22],与发达国家相比处于被动和落后的局面,引起关注度较低,建议今后加强重视程度,继续开展深入的风险监测工作。

3 结论

本研究建立的高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法结合Trace Finder筛查软件对水产品中未知环境污染物进行高通量非定向筛查分析并确证,在此基础上优化前处理条件对筛查化合物准确定量。筛查方法具有快速、高通量、高灵敏度特点,定量准确,可用于未知化学风险的监测分析,为有关风险评估部门监管污染物风险来源提供方向。