高效液相色谱-串联质谱法测定蔬菜水果中双甲脒及其代谢产物

2019-01-05桂茜雯张晓燕沈伟健

色谱 2019年1期

黄娟, 桂茜雯, 高玲, 张晓燕, 沈伟健, 吴斌, 丁涛

(南京海关动植物与食品检测中心, 江苏南京 210019)

双甲脒(amitraz, AMZ)又称N,N-双(2,4-二甲苯亚氨基甲基)甲胺,是一种常见的有机氮杀虫剂和杀螨剂,已广泛用于果树、蔬菜、茶叶、棉花等作物的害虫防治[1]。单甲脒(semiamitraz, DMPF)是双甲脒代谢的中间产物之一,也是良好的杀螨杀虫剂,对螨的各个虫期(卵、若虫、成虫)和抗性螨均有很好的防治效果,曾因其不稳定而无法商品化。但1987年科技工作者解决了关键技术,开始将单甲脒水剂工业化生产,并大面积推广应用[2]。双甲脒及其代谢产物均具有致癌性和可传递性,吸入、摄入或经皮肤吸收均会引起中毒,对肝脏损伤较大,会对人体及动物造成危害[3],其中单甲脒原药的毒性大于双甲脒[4]。

由于双甲脒及其代谢产物的危害严重,各国纷纷制订双甲脒在食用农产品中的限量标准,以保证质量安全。其中,在GB 2763-2016标准中规定双甲脒及其代谢产物在除棉籽油外的其他基质中最大残留限量为0.5 mg/kg,在棉籽油中为0.05 mg/kg[5]。美国规定根据基质的不同双甲脒的限量值在0.02～9 mg/kg之间[6]。日本规定在蔬菜水果中双甲脒及其代谢产物的限量值在0.2～0.5 mg/kg之间[7]。

目前关于AMZ及其最终代谢产物2,4-二甲基苯胺(2,4-dimethylaniline, DMA)的研究报道较多,研究基质主要为动物源性食品,如蜂蜜、牛奶、水产品等,方法主要采用气相色谱法[8]和气相色谱-质谱法[9-11],高效液相色谱法[12]和液相色谱-质谱法[13]也偶有报道。

但实际上,在自然界中AMZ易首先代谢产生DMPF和2,4-二甲基苯基甲酰胺(2,4-dimethylformamidine, DMF)两种中间产物,在没有高温、高湿或酸、碱的环境中,各种代谢产物都可以稳定、独立存在,因此对每种化合物的残留检测都很重要。目前国内外基本集中研究AMZ和DMA[9,11,12],而对DMPF和DMF的研究较少。郭浩等[14]和侯建波等[15]分别针对水和蜂王浆的基质研究了同时检测AMZ及其代谢产物等4种化合物的方法,但对于蔬菜水果这类种类较多且含水含色素较多的复杂基质尚无报道。液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)在抗基质干扰能力、准确性和灵敏度方面具有较强优势,本文利用该技术建立了检测蔬菜水果基质中AMZ、DMPF、DMF和DMA 4种化合物残留量的方法。该法灵敏度高,定量限(LOQ)低于各国残留限量要求,且稳定性和专属性强。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

TSQ Quantiva三重四极杆质谱仪(配备ESI源,美国Thermo公司); Ultimate 3000高效液相色谱仪(美国Dionex公司); Buchi R-200旋转蒸发仪(德国Buchi公司); WH-861涡旋混匀器(太仓市华利达实验设备有限公司); SLGMA2-16K高速离心机(德国Sartorius公司); Z216MK台式高速冷冻离心机(德国Hermle Labortechnic公司); SMART-N15VF超纯水系统(上海力康超纯水有限公司)。

AMZ、DMPF、DMF和DMA(纯度≥98.5%)均购自德国Dr. Ehrenstorfer公司;正己烷、异丙醇、氢氧化钠(分析纯,南京化学试剂股份有限公司);甲醇和乙腈(色谱纯,德国Merck公司);实验用水均为超纯水系统制备的二级水和三级水。

实验用样品均为送至本实验室的待检样品。

1.2 标准溶液的配制

准确称取10 mg标准品,置于10 mL容量瓶中,用乙腈稀释定容,得到质量浓度为1.0 g/L的标准储备液,于0～4 ℃冷藏储存,备用。

取上述标准储备液,用乙腈-水(50∶50, v/v)逐级稀释,配制成质量浓度为1.0 mg/L的标准工作液,于0～4 ℃冷藏储存,备用。

准确吸取适量标准工作液,用空白基质溶液稀释成质量浓度为1.0、5.0、20.0、100.0和200.0 μg/L的标准工作曲线溶液,现用现配。

1.3 样品前处理

准确称取混合均匀的样品5.0 g(精确至0.01 g),置于50 mL塑料离心管中,加入5 mL 0.1 mol/L NaOH溶液,涡旋混匀1 min,再加入15 mL正己烷-异丙醇(2∶1, v/v)提取液,涡旋混合1 min,以8 000 r/min离心5 min,吸取上层液转移至50 mL玻璃离心管中,于35～40 ℃水浴中旋转蒸发浓缩至近干,用0.5 mL乙腈溶解残渣,转移至1 mL离心管中;再用0.5 mL水溶解残渣,转移至同一离心管中,涡旋混匀，然后以12 000 r/min离心3 min,溶液过0.22 μm有机微孔滤膜,供仪器分析。

1.4 分析条件

色谱柱:Phenomenex Kinetex C18柱(100 mm×4.6 mm, 2.6 μm);柱温:35 ℃;流动相:A相为0.1%(v/v)甲酸水溶液,B相为甲醇;流速:0.5 mL/min。梯度洗脱程序:0～2.0 min, 10%B; 2.0～3.0 min, 10%B～90%B; 3.0～8.0 min, 90%B; 8.0～9.5 min, 90%B～10%B, 9.5～10.5 min, 10%B。进样量:25 μL。

离子源为电喷雾电离(ESI)源;扫描方式为正离子扫描;离子源温度为350 ℃;离子传输管温度为300 ℃;毛细管电压为3 200 V;气帘气为氮气,压力为0.060 MPa;辅助气为氮气,流量为5.0 L/h;碰撞气为氩气,压力为0.2 Pa(1.5 mTor);检测方式为多反应监测(MRM)模式。双甲脒及其代谢产物的母离子、子离子和碰撞能量见表1。

图 1 双甲脒的代谢路径Fig. 1 Metabolism routes of AMZ

CompoundParent ion (m/z)Daughter ion (m/z)Collision energy/eVAMZ294.26163.11*15122.2529DMPF163.08122.18*17107.1825DMF150.18107.00*21132.0413DMA122.09107.16*18105.1618

* Quantitative ion.

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂的优化

AMZ在酸性环境下不稳定,环境pH值小于2时迅速降解成DMA,在pH值为3～6时,AMZ先水解成DMPF和DMF两种中间体,然后再进一步降解成稳定的DMA(见图1)。随着pH值的提高,AMZ的水解速率明显下降,稳定性增高,因此在提取溶剂中加入碱性溶液,可以防止AMZ在提取过程中的降解。

AMZ为胺类化合物,属于两性化合物,加酸形成盐,加碱形成游离分子,结合酸性易降解的特性和相似相容原理,在碱性条件下分子形态的AMZ更易被有机试剂溶解提取。本文考察了对AMZ及其代谢产物溶解度较大的丙酮、甲醇、正己烷和正己烷-异丙醇(2∶1, v/v)4种有机试剂的提取效率(见图2)。结果表明,丙酮和甲醇的提取效率较高,正己烷-异丙醇(2∶1, v/v)和正己烷的提取效率较低,但对于本文研究的蔬菜水果基质来说,丙酮由于吸附了较多的色素,使后期仪器分析中基质干扰变大;甲醇除了吸附色素外,还因其具有亲水性,会导致提取液中含有部分水分,从而使双甲脒发生水解。正己烷作为非极性物质,可以在提取过程中将水分和易溶于水的色素剔除,从而达到提取和净化的目的。在提取液中加入少量异丙醇,可以让AMZ及其代谢产物在提取溶剂中更加稳定,同时防止在后期的旋转蒸发过程中暴沸。因此本文选择正己烷-异丙醇(2∶1, v/v)作为提取溶剂。

图 2 不同提取溶剂对4种目标化合物提取效率的影响Fig. 2 Effect of different extraction solvents on the extraction efficiencies of the four target compounds

2.2 定容溶剂的选择

在仪器分析中,定容溶剂直接影响了分析物的峰形、分离度和灵敏度。色谱分析中,一般采用流动相定容,本文比较了0.1%(v/v)甲酸水溶液-甲醇(1∶9, v/v)溶液和乙腈-水(1∶1, v/v)溶液作为定容溶剂时的色谱分离效果。同时添加1 mL 1.0 mg/L的混合标准溶液至定容溶剂中,常温放置一段时间,观察放置时间对AMZ稳定性的影响。实验发现,采用0.1%(v/v)甲酸水溶液-甲醇(1∶9, v/v)溶液定容后,AMZ在7 h时几乎完全分解,而采用乙腈-水(1∶1, v/v)溶液定容后,AMZ可以保持24 h内稳定存在(见图3)。因此选择乙腈-水(1∶1, v/v)溶液作为定容溶剂。

图 3 AMZ在不同定容溶剂中的降解图Fig. 3 Degradation of the AMZ dissolved in the different solvents

图 4 AMZ及其代谢产物(100 μg/L)的选择离子色谱图和二级离子质谱图Fig. 4 SIM chromatograms and MS2 spectra of AMZ and its metabolites (100 μg/L)

2.3 质谱条件的优化

2.3.1质谱参数

在正离子模式下对1.0 mg/L AMZ及其代谢产物的混合标准溶液进行全扫描,得到[M+H]-准分子离子峰,分别选择该分子离子峰进行了二级质谱扫描。在MRM、正离子模式下,优化质谱参数,分别选择信噪比高、峰形好、干扰小的子离子作为定量离子,选择特异性强的子离子作为定性离子。图4为AMZ及其代谢产物混合标准溶液(100 μg/L)的选择离子色谱图和二级离子质谱图。

2.3.2基质效应

双甲脒及其代谢产物在质谱上的离子抑制较强,因此,本文测定了目标化合物在空白基质标准溶液和溶剂标准溶液(100 μg/L)的峰面积,通过两者峰面积差值的绝对值与溶剂标准溶液峰面积的比值,计算离子抑制率,来评价基质效应。结果表明,AMZ、DMPF、DMF和DMA的离子抑制率分别为23.9%、35.9%、7.9%和19.6%,说明基质对AMZ、DMPF和DMA的离子抑制相对较强。因此本文采用空白基质添加标准溶液的方式配制标准工作曲线溶液来减弱基质效应。

2.4 方法学验证

2.4.1线性范围与定量限

取适量标准工作液用空白基质溶液分别配制成质量浓度为1.0、5.0、20.0、100.0和200.0 μg/L的标准工作曲线溶液,按本方法确定的条件分别进样分析,以目标化合物的峰面积对其质量浓度绘制标准曲线。结果表明,4种目标化合物在线性范围内呈良好的线性关系,线性相关系数(r)均大于0.99(见表2)。以信噪比(S/N)>10确定4种目标化合物的定量限,结果为0.01～0.4 μg/kg。

表 2 4种目标化合物的回归方程、相关系数和定量限Table 2 Regression equations, correlation coefficients (r) and limits of quantification (LOQs) of the four target compounds

Y: peak area;X: mass concentration, μg/L.

2.4.2回收率和精密度

对青菜和柑橘两种代表性基质进行0.5、5.0、20.0 μg/kg 3个水平的添加回收试验,每个水平重复6次,测定两种基质中AMZ及其代谢产物的平均回收率和相对标准偏差(见表3)。结果表明,方法的平均回收率为62.5%～105.0%,相对标准偏差为7.5%～17.6%。

2.5 实际样品测定

应用本方法对近期送至本实验室的32批蔬菜包括黄瓜、青(红)椒、茄子、玉米粒、针菇和番茄等各种基质的样品进行测定,发现共检出4批阳性样品,番茄样品检出AMZ,含量为1.5 μg/kg;黄瓜和白金针菇检出DMA,含量分别为2.1 μg/kg和3.5 μg/kg;红椒检出DMPF,含量为0.2 μg/kg。

表 3 青菜和柑橘中AMZ及其代谢产物在3个加标水平下的加标回收率及相对标准偏差(n=6)Table 3 Recoveries and relative standard deviations (RSDs) of the AMZ and its metabolites at three spiked levels in green vegetable and orange samples (n=6)