γ-Al2O3-氧化石墨烯吸附材料用于尿液中核苷的检测

侯星羽, 黄 玮, 佟育奎, 朱富贵, 田苗苗

(黑龙江省光化学生物材料与储能材料重点实验室, 哈尔滨师范大学化学化工学院, 黑龙江 哈尔滨 150025)

核苷作为核酸的主要组分,不仅参与DNA和RNA的生物合成,还参与控制和管理人体多种生理过程,呈现多种生物活性,是生物细胞维持生命的重要物质,具有免疫调节、改善脑细胞代谢、镇静中枢神经等多种药理生理活性[1,2]。如肌苷可治疗急、慢性肝炎及风湿性心脏病;胞苷可作为升高白细胞的药物;尿苷对治疗肝、脑血管、心血管等疾病有重要功效等。人体尿液中化学成分十分复杂,相对于其他成分而言,核苷含量较低,在分析过程中容易受到干扰而影响检测结果的准确度。能够实现对核苷组分有效分离和正确鉴别的高灵敏度和高选择性的定量检测方法是研究核苷应用的关键。

近年来已开发几种色谱方法用于分析尿液中的核苷,如:高效液相色谱(HPLC)法[3]、液相色谱-质谱(LC-MS)法[4,5]、毛细管电泳与紫外检测(CE-UV)法[6]等。常用的预浓缩技术有固相萃取(SPE)技术、液相微萃取、固相微萃取、浊点萃取等,由于SPE具有回收率高、萃取时间短、富集系数高、有机溶剂消耗量少、成本低、易于操作等特点而成为最广泛使用的预浓缩方法[7,8]。随着新型待测物的不断涌现,SPE所用的吸附剂也得到了相应的发展。氧化石墨烯(GO)材料由于其超大的比表面积和丰富的含氧基团(羧基、羟基和环氧基),通过氢键等分子间作用力实现对不同化合物的吸附,成为理想的吸附材料[9,10]。研究者们[11,12]凭借着其表面官能团的可修饰性,在GO的基础上研发出了众多的GO复合吸附材料,赋予其新的性质,进一步拓展其应用领域。因GO容易团聚,在水溶液中分散性差,为有效阻止本身的团聚现象,可在其表面具有的丰富含氧基团上键合纳米氧化物。纳米氧化物是目前生产、使用最为广泛的纳米材料,包括二氧化钛、铁氧化物、氧化硅以及氧化铝等,由于纳米氧化物具有较大的比表面积和反应活性,使其成为一种理想的吸附材料。其中γ-Al2O3纳米粒子是一种孔径均匀的多孔材料,有着比表面积大、孔隙率高、吸附能力较强及在多种有机溶剂中良好的分散性等优点[13],γ-Al2O3纳米粒子表面的羟基可以与GO表面的含氧基团发生反应。本文以GO为载体,在其表面键合γ-Al2O3纳米粒子,合成了γ-Al2O3-GO吸附剂。由于兼具γ-Al2O3和GO的优点,可提高γ-Al2O3-GO吸附剂的吸附能力,具有很好的稳定性,便于应用在分析等领域。

本文将γ-Al2O3-GO作为吸附剂,考察了影响SPE的各种因素。在最佳萃取条件下,对人体尿液中的核苷类物质进行预富集,并结合高效液相色谱技术进行分析测定,在9 min内完成了4种核苷的快速分离检测。对γ-Al2O3-GO吸附剂进行了透射电镜、热重分析及红外光谱等表征,考察了其对4种核苷检测的线性范围、检出限、稳定性、重复性等性能,并系统地研究了该吸附剂的吸附效果,使用新制备的γ-Al2O3-GO作为SPE吸附剂从复杂基质中富集目标分析物。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

LC-20AT型高效液相色谱仪配有LC-20AT流动相输液泵、SIL-20A自动进样器、CTO-20A色谱柱柱温箱、SPD-20A紫外检测器和LabSolutions工作站(日本Shimadzu公司)。色谱柱为反相色谱柱(Diamonsil C18, 250 mm×4.6 mm, 5 μm,美国Thermo Fisher公司)。ASE-12固相萃取仪(天津奥特赛恩斯仪器公司); SPE空柱(天津天豪仪器公司); JSM 2000-F透射电子显微镜(日本JEOL公司); TENSORⅡ红外光谱仪(德国Bruker仪器公司); Q500热重分析仪(美国TA公司); pH-10型酸度计(北京赛多利斯科学仪器公司); Milli-Q SP型纯水系统(美国Millipore公司); JJ-1磁力电动搅拌器(金坛市江南仪器厂); ZK-82BB真空干燥箱(上海实验仪器有限公司); LD5-2A离心机(北京京立仪器公司); 0.45 μm有机相滤膜(上海阿拉丁化学试剂有限公司)。

标准品(胞苷、尿苷、肌苷、鸟苷,纯度均≥98%,上海阿拉丁化学试剂有限公司);乙醇(EtOH)、甲醇(MeOH)、三氟乙酸(TFA)、乙腈(ACN)、NaH2PO4、H3PO4、NaOH(均为分析纯,北京化工厂);石墨粉(纯度99.95%)、γ-Al2O3(纯度99.9%)、石英砂(粒度150 μm)(上海国药集团化学试剂有限公司);MeOH(色谱纯,美国Fisher Scientific公司)。

1.2 溶液配制

称取一定量的上述4种标准品(胞苷、尿苷、肌苷、鸟苷),用去离子水(DDW)进行稀释,配制成100 mg/L的标准储备液,置于4 ℃冰箱中密封保存备用。称取一定质量的NaH2PO4配制成0.02 mol/L的磷酸盐缓冲溶液,并用H3PO4和NaOH调节溶液的pH值。

1.3 色谱条件

流动相A为H2O,流动相B为MeOH,在使用之前,流动相需经0.45 μm滤膜过滤并脱气30 min。使用MeOH/H2O(1∶9, v/v)等度洗脱;流速:0.9 mL/min;紫外检测波长:260 nm;柱温:35 ℃;进样量:10 μL。

1.4 γ-Al2O3-GO吸附剂的制备

利用Hummers氧化法[14]合成GO。具体操作如下:将一定量的石墨粉和NaNO3在电动搅拌的作用下缓慢加入到浓H2SO4中,搅拌均匀后,向混合物中加入一定量的KMnO4, 35 ℃恒温水浴并搅拌30 min。缓慢加入DDW稀释,用10%(体积分数,下同)的H2O2还原剩余的KMnO4,最后趁热离心去除上层清液,再用10%的HCl离心洗涤,以去除金属离子,接着用DDW去除酸,70 ℃下水浴干燥,即可得到片状的GO。

将100 mg GO加入到10 mL EtOH中,超声分散1 h,得到10 g/L GO-EtOH分散液。分别将10、20和30 mg的γ-Al2O3纳米粒子加入到上述3份GO-EtOH分散液中,制备不同γ-Al2O3/GO重量比的吸附剂。将3份混合物继续超声处理30 min,最后在电磁搅拌的作用下于70 ℃水浴中干燥、研磨,即可得到γ-Al2O3-GO吸附剂。制备过程见图1。

图 1 γ-Al2O3-GO吸附剂合成示意图Fig. 1 Schema of the preparation of the γ-Al2O3-GO absorbentEtOH: ethanol.

1.5 SPE柱的制备

将3 mL SPE柱、上下聚乙烯(PE)筛板用0.10 mmol/L HCl溶液浸泡24 h,再用DDW进行多次洗涤。干燥后,分别称取0.10 gγ-Al2O3-GO和0.10 g石英砂混合物填入SPE空柱中,柱子的两端用PE筛板盖实,即制得SPE柱。

1.6 SPE步骤

SPE柱分别用2 mL MeOH和2 mL DDW活化,将2 mL样品溶液上样到活化好的SPE柱,利用γ-Al2O3-GO SPE柱富集样品中的胞苷、尿苷、肌苷、鸟苷,富集后用磷酸盐缓冲溶液冲洗多余杂质,负压抽干。最后,选用0.5 mL含1%TFA的ACN/H2O (3∶7, v/v)洗脱萃取柱上的核苷类物质,收集洗脱液,经0.45 μm滤膜过滤,采用HPLC进行分析检测。

2 结果与讨论

2.1 γ-Al2O3-GO吸附剂的表征

2.1.1透射电镜

GO和γ-Al2O3-GO的形貌和大小使用透射电镜(TEM)表征。图2a为GO的TEM图,由图中可知,GO表面光滑,没有颗粒物存在,而且颜色与基底铜网上碳膜颜色非常接近,说明所得到的氧化石墨烯是非常薄的片状结构。图2b～d分别为γ-Al2O3加入量为10、20和30 mg时γ-Al2O3-GO吸附剂的TEM图。从图2b和2c中可以看到许多非常细小的颗粒物,这些颗粒物都均匀地分布在氧化石墨烯表面。图2d表明,当γ-Al2O3的加入量为30 mg时,吸附剂的均匀程度降低,并发生聚集现象,但出于对萃取效率的考虑,过少的加入量会导致萃取效率下降,最终选取20 mgγ-Al2O3为最佳加入量。当γ-Al2O3加入量为20 mg时,吸附剂表面颗粒分布均匀,说明γ-Al2O3和GO成功复合在一起。后续实验均选用γ-Al2O3加入量为20 mg。

图 2 (a)GO和γ-Al2O3加入量分别为(b)10、 (c)20和(d)30 mg时γ-Al2O3-GO吸附剂的透射电镜图 Fig. 2 Transmission electron microscopy (TEM) images of (a) graphene oxide (GO)and the γ-Al2O3-GO absorbent comprising (b) 10, (c) 20, and (d) 30 mg γ-Al2O3

2.1.2红外光谱分析

从图3a中可以看出,γ-Al2O3-GO吸附剂的红外光谱在3 410、1 621、1 020以及620 cm-1处有较强的吸收峰。其中3 410 cm-1处的吸收峰对应GO的-OH峰、-COOH峰和γ-Al2O3的H2O峰;1 725 cm-1处的吸收峰是GO边缘羧基、羰基中的C = O的伸缩振动;1 621 cm-1处的强吸收峰对应γ-Al2O3的悬挂键和GO的C = C振动峰;1 340 cm-1处的特征峰为GO的环氧基(C-O-C)[15]; 1 020 cm-1处吸收峰可能来自于γ-Al2O3上γ-OH的弯曲振动;620 cm-1处的吸收峰可能归因于Al-O的伸缩振动。以上这些特征吸收峰的出现说明成功地制备了γ-Al2O3-GO吸附剂。

2.1.3热重分析

图3b是γ-Al2O3-GO吸附剂的热重分析(TGA)曲线,从图中可知,100 ℃之前,材料几乎没有重量损失;100～250 ℃的失重主要是由于吸附剂表面的水分子或有机小分子化合物的挥发;250～600 ℃吸附剂发生明显的重量损失;当温度高于750 ℃时,TGA曲线趋于平衡。说明合成的γ-Al2O3-GO吸附剂热稳定性良好。

图 3 (a)GO和γ-Al2O3-GO吸附剂的傅里叶红外吸收图谱及 (b)γ-Al2O3-GO吸附剂的热重分析曲线Fig. 3 (a) Fourier transform infrared spectroscopy (FT- IR) spectra of GO and γ-Al2O3-GO absorbent, and (b) thermal gravimetric analysis (TGA) curve of γ-Al2O3-GO absorbent

2.2 吸附性能

将2 mL 1 mg/L的核苷(胞苷、尿苷、肌苷、鸟苷)混合样品溶液加入γ-Al2O3-GO SPE柱中,收集洗脱液,将清液用0.45 μm滤膜过滤后,用HPLC分析检测其浓度。用公式(1)评价吸附剂的吸附能力:

(1)

式中Qe代表吸附量(μg/g),C0和C1分别为目标分析物在水样中的初始浓度(mg/L)和经SPE吸附后的质量浓度(mg/L),V为样品体积(mL),m为γ-Al2O3-GO吸附剂的用量(g)。

2.3 实验参数的优化

2.3.1洗脱液种类优化

根据被测物质的极性优化洗脱液的种类。分别以含1%TFA的MeOH/H2O(3∶7, v/v)、MeOH/H2O(9∶1, v/v)、MeOH、含1%TFA或3%TFA或5%TFA的ACN/H2O(3∶7, v/v)为洗脱液,比较各种洗脱液对核苷的洗脱效果,结果如图4a所示。通过计算其回收率,含1%TFA的ACN/H2O(3∶7, v/v)具有较好的洗脱效果。由于TFA可以和目标分析物发生亲水作用,因此,后续试验选取含1%TFA的ACN/H2O(3∶7, v/v)作为洗脱液。

2.3.2γ-Al2O3-GO吸附剂用量的优化

考察了填充在SPE柱中的γ-Al2O3-GO吸附剂用量对实验结果的影响。为确保SPE柱填料的均匀性,增大SPE柱的渗透性,采用石英砂与吸附剂混合装柱,与未加石英砂的吸附柱相比,γ-Al2O3-GO吸附剂填充的更加均匀紧密,净化效果更好。将0.05、0.08、0.10、0.12和0.15 gγ-Al2O3-GO吸附剂分别与0.10 g石英砂均匀混合后填充在SPE柱中,对核苷进行吸附,结果如图4b所示,当吸附剂用量为0.10 g时,吸附量达到最高。随着吸附剂用量的增加,吸附量有所下降且逐渐达到平衡。因此,选择γ-Al2O3-GO吸附剂的用量为0.10 g。

2.3.3样品体积的优化

从图4c可以看出,当样品体积为0.5、1.0、1.5、2.0 mL时,随着体积的增加,吸附量逐渐增大,但当样品体积大于2.0 mL时,由于SPE柱对核苷基本吸附完全,吸附量值无明显变化。并且样品体积过大,将导致分析时间延长。所以,选择样品体积为2.0 mL。

图 4 (a)洗脱液种类、(b)吸附剂用量、(c)样品体 积和(d)样品pH值的优化(n=3)Fig. 4 Optimization of (a) eluent type, (b) absorbent amount, (c) sample volume, and (d) sample pH (n=3) TFA: trifluoroacetic acid; MeOH: methanol; ACN: acetonitrile; Q: absorbent amount.

2.3.4样品pH值的优化

样品pH值是影响吸附效率的一个重要因素,本试验研究了样品pH在5.0～11.0范围内对吸附效率的影响,结果(见图4d)表明,核苷的吸附量在pH为10.0时达到最大值。可能是因为核苷表面的羧基与γ-Al2O3-GO吸附剂中GO表面的羧基及γ-Al2O3表面的羟基形成氢键作用,且存在静电作用。当pH小于10.0时,随着pH的下降,γ-Al2O3-GO吸附剂与核苷之间的氢键和静电作用逐渐减小,所以吸附效率减低。而pH过高也不利于吸附,所以本试验选择的最佳pH值为10.0。

2.4 方法评价及实际样品分析

2.4.1方法评价

在上述优化的实验条件(γ-Al2O3-GO吸附剂用量0.10 g、样品体积2.0 mL、pH 10.0)下,采用γ-Al2O3-GO SPE柱对核苷进行萃取、洗脱和检测。由于基质效应的影响,可能会导致待测物发生抑制作用,本试验在实际样品分析前,采用基质加标法,得到工作曲线。称取相同基质的空白样品,分别加入不同体积的标准储备液,用加标空白实际样品经萃取洗脱后的浓度与对应的色谱峰面积,建立了4种核苷类物质的工作曲线。结果如表1所示,曲线的线性范围在不同质量浓度水平(胞苷、肌苷、鸟苷为0.10～10 mg/L,尿苷为0.05～10 mg/L)下具有较好的线性关系,相关系数(R2)为0.996 7～0.997 3。检出限(LOD)和定量限(LOQ)分别以信噪比的3倍和10倍计算,分别为0.010～0.021和0.033～0.070 mg/L。在测量次数均为3次时,方法的日内和日间(连续3 d)精密度分别为0.1%～0.8%和1.0%～3.1%,说明该方法具有良好的重现性。

表 1 γ-Al2O3-GO吸附剂对4种核苷的线性范围、R2、检出限、定量限和相对标准偏差(n=3)Table 1 Linear ranges, correlation coefficients (R2), limits of detection (LOD), limits of quantification (LOQ) and RSDs of γ-Al2O3-GO absorbent of the four nucleosides (n=3)

为了进一步说明γ-Al2O3-GO作为一种新型吸附剂应用于SPE-HPLC方法检测的优点,将该方法得到的检出限和定量限等与其他在不同实际样品基质中检测核苷的方法[3,16-20]进行了比较,结果见表2。从表中可见,本方法具有相对较低的LOD和LOQ。另外,相比之下,本方法应用的γ-Al2O3-GO SPE-HPLC检测具有简便、省时、成本低等优点。

表 2 比较测定核苷类物质的不同样品前处理技术和检测方法Table 2 Comparison of different sample preconcentrations and detection methods for the determination of nucleosides

表 2 (续)Table 2 (Continued)

DSPE: dispersive solid-phase extraction; MSPD: matrix solid-phase dispersion extraction; ND: not detected.

图 5 4种核苷经γ-Al2O3-GO吸附剂 富集前后的HPLC峰面积对比Fig. 5 Comparison of the HPLC peak areas of the four nucleosides before and after the enrichment with γ-Al2O3-GO absorbent

图 6 γ-Al2O3-GO SPE-HPLC方法获得的尿液样品色谱图Fig. 6 Chromatograms of urinary samples obtained by the γ-Al2O3-GO SPE-HPLC method a. blank sample; b. sample spiked with 0.5 mg/L mixed standard solution; c. sample spiked with 1.0 mg/L mixed standard solution; d. sample spiked with 2.0 μg/mL mixed standard solution.

2.4.2对比研究

在最优化的实验条件下,对比了4种核苷类物质没有经过富集直接经HPLC分析得到的峰面积与采用γ-Al2O3-GO作为吸附剂富集核苷后再进行HPLC分析所得到的峰面积。结果(见图5)表明,经过富集后的核苷峰面积响应值明显高于富集前。表明γ-Al2O3-GO吸附剂对核苷具有一定的富集能力。可能有以下原因:首先,GO具有较大的比表面积,丰富的π-π共轭键,表面所含的羟基、羧基和环氧基团可以通过氢键作用来提高对分析物的吸附能力。其次,GO不易溶于水,在水溶性溶液中易发生聚集,不利于分离,这降低了GO的萃取效率,γ-Al2O3-GO吸附剂可以在萃取过程中保持GO的片层结构,同时,γ-Al2O3表面的亲水基团使其对水溶液中分析物的萃取效率大大提高。最后,核苷中的羟基或氨基与γ-Al2O3纳米粒子的羟基(γ-Al2O3纳米粒子在质子溶液中会形成羟基[13])形成氢键。从而提高改性吸附剂对目标分析物的吸附能力。

2.4.3实际样品检测

选取5个正常人的临床尿液样本检测胞苷、尿苷、肌苷和鸟苷的含量。将尿液样本用pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液稀释10倍,置于离心管中。在SPE-HPLC操作前,所有稀释后的尿液都需用0.45 μm滤膜过滤除杂。使用该方法对5个尿液样本进行加标回收率的测定(加标值分别为0.5、1.0和2.0 mg/L),实际样品1的色谱图和其加标色谱图见图6。实际样品中4种核苷的含量以及加标回收率的分析结果见表3。表中数据为3次测定的平均值,加标回收率为71.3%～107.4%,相对标准偏差不大于4.8%。结果表明,该方法适用于尿液中核苷含量的检测,有效避免了基质的影响,并对分离和富集实际样品中低浓度的核苷类化合物提供了一定的理论依据。

3 结论

本实验成功地制备了γ-Al2O3-GO新型吸附剂,γ-Al2O3纳米颗粒的亲水表面增强了该吸附剂在水溶性样品中的分散,避免了石墨烯片层在水溶液中发生不可逆的团聚,提高了对目标物的萃取率。将该材料作为SPE吸附剂结合HPLC检测手段,在最优的实验条件下,考察了该方法对核苷的富集能力和回收率,建立了富集与检测人体尿液样品中核苷类物质的方法。其结果令人满意,为进一步分析研究核苷类物质提供了新的途径和方法。