TMPRSS2-ETS融合基因在前列腺导管内癌诊断中的应用

丘佳明,姚文英,王晓燕,魏 炜,林小星,蔡为民,盛仁明

(1.常熟市第二人民医院 病理科,江苏 常熟215500；2.常熟市第一人民医院 病理科)

前列腺癌是老年男性常见的恶性肿瘤。近年来随着血清PSA筛查和前列腺穿刺活检技术的完善,前列腺癌及其癌前病变的检出率越来越高[1]。WHO(2016)泌尿系统和男性生殖器官肿瘤分类中明确列出了前列腺导管内癌(IDC-P)这一新的组织类型[2],而它与高级别前列腺上皮内瘤 (HGPIN)、前列腺浸润性筛状癌和前列腺导管腺癌均具有相似的镜下结构却有不同的临床意义[3]。免疫组化方法检测鸡尾酒抗体(P504s+CK34βE12+P63)为目前较常应用于前列腺癌的鉴别诊断方法,但在实际临床工作中,经常会出现穿刺活检较小、较破碎的组织,极易出现鉴别诊断困难,而且其中IDC-P与HGPIN免疫表型特点相近,免疫组化检测对二者鉴别帮助不大[3]。

跨膜丝氨酸蛋白酶2(TMPRSS2)基因与ETS转录因子基因家族成员的融合,具有前列腺特异性,并在前列腺癌发生、发展过程中发挥重要作用[4]。ETS转录因子基因家族成员包括ERG、ETV1、ETV4这三种基因,他们与TMPRSS2基因的融合,目前认为是前列腺癌中常见的基因突变。本文采用荧光原位杂交技术(FISH)检测TMPRSS2-ETS融合基因在IDC-P、HGPIN、浸润性筛状癌和导管腺癌中的表达,并以良性前列腺增生和正常前列腺组织作为对照,以期为它们的诊断提供帮助。同时采用免疫组化方法标记鸡尾酒抗体在它们中的表达,比较FISH与免疫组化在前列腺疾病诊断中的作用,为解决前列腺疾病诊断中的难题提供帮助。

1 材料与方法

1.1 一般资料

收集2013年1月至2017年12月送检至我科和常熟市第一人民医院病理科的前列腺蜡块标本及其病理切片,根据WHO(2016)泌尿系统和男性生殖器官肿瘤分类中的诊断标准[2],复习病理切片,选取其中肿瘤成分较多的IDC-P、HGPIN、浸润性筛状癌和导管腺癌各40例,以及良性前列腺增生和正常前列腺组织各20例作为对照。

1.2 制备组织芯片

首先对已筛选的病理切片进行观察,然后在显微镜下选取代表性区域,用笔在相应供体蜡块的相应位置上标记取材部位。另外制备空白蜡块作为受体蜡块。应用打孔针取标记组织,放入受体蜡块上对应的小洞内。每个芯片40个位点,间距为0.2厘米。病变组织按照类别制成五份组织芯片,分别为IDC-P、HGPIN、浸润性筛状癌和导管腺癌各一份,以及良性前列腺增生加正常前列腺组织一份。

1.3 试剂

FISH检测所需ERG、TMPRSS2、ETV1、ETV4基因异常检测试剂盒(F.01011-01)购自广州安必平医药科技股份有限公司,包括ERG断裂探针、TMPRSS2-ETV1融合探针和TMPRSS2-ETV4融合探针。免疫组化检测所需前列腺癌双染试剂盒(DS-0106)购自北京中杉金桥生物技术有限公司,包括P504s、P63和CK34βE12这三个抗体。

1.4 FISH检测

取制备好的组织芯片,常规切片,厚为4微米,放入70℃烘箱内1小时,脱蜡采用二甲苯两缸各5分钟,脱水采用无水乙醇两缸各5分钟,然后室温风干。接着,先后浸入煮沸的去离子水中40分钟,37℃蛋白酶K溶液中20分钟,用柠檬酸钠缓冲液进行漂洗,梯度酒精(70%、85%、100%)脱水,室温风干。每张切片滴加10 μl探针液,盖上盖玻片,放入原位杂交仪进行变性杂交,设定变性条件为88℃、5分钟,杂交条件为42℃、16小时。之后,用甲酰胺和SSC溶液浸洗,70%的乙醇脱水,避光室温风干。滴加10 μl的4,6-联脒-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)复染剂,盖上盖玻片,避光放置10分钟,进行镜下诊断。

1.5 免疫组化检测

组织芯片的切片脱蜡脱水步骤同FISH,然后放入EDTA溶液(pH8.0)中100℃20分钟进行抗原修复。先后放入过氧化物酶阻断剂溶液、正常非免疫动物血清中室温10分钟,加鸡尾酒抗体,室温60分钟。加二抗,室温15分钟,加碱性磷酸酶显色剂,10-20分钟,加辣根过氧化物酶显色剂(AEC显色剂)10-20分钟,加苏木素10-20秒,以上每一步骤结束均需PBS溶液冲洗3次,每次3分钟然后进行下一步骤。最后浸入PBS溶液后可自来水冲洗,烘干封片。

1.6 结果判读

1.6.1ERG断裂探针正常信号类型为两融合(2F),即细胞核内同时存在的两对红绿信号点,当出现TMPRSS2-ERG基因融合重排时,信号类型为一红一绿一融合(1R1G1F)、或者一红一绿(1R1G)、或者多绿一融合(nG1f)。TMPRSS2-ETV1与TMPRSS2-ETV4融合探针的信号类型相同,正常信号类型为两红两绿(2R2G),典型异常信号类型为一红一绿两融合(1R1G2F)。荧光显微镜下观察至少50个肿瘤细胞,<10%判定为阴性,>50%判定为阳性,在10%-50%之间则需另观察50个肿瘤细胞,两次结果相加计算百分率,<15%判定为阴性,≥15%判定为阳性。

1.6.2鸡尾酒抗体为红色和棕褐色双染,P504s呈红色颗粒状,定位于肿瘤细胞浆,P63和CK34βE12呈棕褐色,分别定位于基底细胞胞核和胞浆。

1.7 统计学方法

用SPSS20.0软件对本实验所得数据进行统计学处理,IDC-P与其它组比较采用χ2检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FISH方法检测

2.1.1在IDC-P、浸润性筛状癌、导管腺癌三组病例中检测结果近似,出现TMPRSS2-ERG融合重排信号异常的阳性标本分别为有27例、25例、24例,TMPRSS2-ETV1阳性病例分别为3例、2例、3例,TMPRSS2-ETV4阳性病例分别为1例、1例、0例。TMPRSS2-ETS的相关基因在以上三组病例的总阳性率分别为77.5%(31/40)、70%(28/40)、67.5%(27/40),差异没有统计学意义(P>0.05)。

2.1.2在HGPIN组病例中,出现TMPRSS2-ERG融合重排信号异常的阳性标本有2例,在未出现TMPRSS2-ERG融合重排的标本中,TMPRSS2-ETV1、TMPRSS2-ETV4均为正常信号类型,未见融合重排信号异常,TMPRSS2-ETS相关基因的总阳性率为5%(2/40)。在良性前列腺增生和正常前列腺组织中,表达与HGPIN组相近,仅出现1例正常前列腺组织TMPRSS2-ERG融合重排信号异常阳性,其余均为正常信号类型。故IDC-P组较HGPIN组、良性前列腺增生和正常前列腺组织病例差异明显,具有统计学意义(P<0.05)。

2.2 免疫组化方法检测

2.2.1检测鸡尾酒抗体,其中P504s抗体的阳性率,在IDC-P为75%(30/40),在HGPIN为32.5%(13/40),在浸润性筛状癌为100%(40/40),在导管腺癌为95%(38/40),表达呈弱阳性至强阳性。IDC-P组与以上另外三组相比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。在良性前列腺增生和正常前列腺组织中,P504s均阴性,较IDC-P具有明显差异性。

2.2.2鸡尾酒抗体中的另外两个抗体CK34βE12和P63,在IDC-P和HGPIN表达相似,大部分腺管基底膜可见连续阳性或断续阳性,阳性率均为90%(36/40),在良性前列腺增生和正常前列腺组织中阳性率为100%(40/40),而它们在浸润性筛状癌和导管腺癌病例中大部分表达缺失,出现3例浸润性筛状癌和1例导管腺癌病灶中间的少量散在弱表达,视为表达阴性。故对于CK34βE12和P63这两个抗体来说,IDC-P组与浸润性筛状癌、导管腺癌组差异均具有统计学意义(P<0.05),IDC-P与HGPIN组、良性前列腺增生和正常前列腺组织差异均不具有统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

前列腺导管内癌这个名词最早是在1972年由Rhamy等[5]提出,经过不断地研究和总结,发现无论在前列腺手术切除标本还是穿刺活检标本,IDC-P都与几种提示预后不良的临床病理因素存在明确的相关性,包括Gleason评分高、肿瘤体积大、累及精囊腺、前列腺外侵犯和淋巴结转移等等[6]。WHO(2016)泌尿系统和男性生殖器官肿瘤分类中首次明确列出了IDC-P这一组织类型[2],定义为腺泡上皮和(或)导管上皮的肿瘤性增生,相比HGPIN具有更高的组织学和(或)细胞学的异形性,与高分期、高分级的前列腺癌的发生具有显著相关性。IDC-P组织学特征是肿瘤细胞局限在导管内或腺泡内,可沿着导管和腺泡进行浸润播散,并且基底细胞层保存或部分保存。很多学者实验了不同的方法,将IDC-P与HGPIN、浸润性筛状癌、导管腺癌等组织学特征近似的前列腺肿瘤相鉴别[3,7],研究发现,IDC-P与HGPIN具有极为近似的免疫组化表达特点,包括鸡尾酒抗体和PSA的表达,常规的免疫染色对于鉴别两者并没有帮助,IDC-P与浸润性筛状癌、导管腺癌这两组病例可以分别通过鸡尾酒抗体进行鉴别。所以,IDC-P与HGPIN运用常规方法难以鉴别,是目前病理诊断中的难点。

为了对IDC-P和HGPIN进行鉴别,Lotan等[8]和Morais等[9]先后应用免疫组化方法检测二者肿瘤细胞胞质中与张力蛋白同源的第10号染色体缺失的磷酸酶基因(PTEN),结果均出现PTEN的缺失,分别为84%和76%,而HGPIN的表达正好相反,但该研究尚未通过大样本量的前瞻性研究证实且敏感性不高,可以作为二者鉴别诊断中的辅助参考指标。Han[10]等和Shah[11]等分析IDC-P和HGPIN具有明显地组织学相似性,常规诊断标准无法鉴别,在无浸润性癌的穿刺标本中,基因检测可帮助鉴别IDC-P和HGPIN,若出现TMPRSS2-ETS融合基因,则倾向IDC-P。该研究与本文研究方法相近,结论近似,均支持FISH检测TMPRSS2-ETS融合基因在IDC-P和HGPIN鉴别中的重要作用,但该研究样本量较少,且局限于无浸润性癌的情况,而实际工作中,IDC-P大部分都伴随着Gleason评分高、肿瘤体积大的预后不良的浸润性癌[6],IDC-P是前列腺癌进展的高风险因素,无论是否合并浸润性癌,均应明确诊断IDC-P,故本文选择病例并未区分是否伴有浸润,本文研究结论与该研究相近,说明无论是否伴有浸润性癌,不影响IDC-P和HGPIN的鉴别。

总而言之,IDC-P与HGPIN、浸润性筛状癌、导管腺癌难以鉴别,是目前病理诊断中的难点,运用免疫组化方法检测鸡尾酒抗体可以初步将IDC-P、HGPIN这两个肿瘤与浸润性筛状癌、导管腺癌鉴别,运用FISH检测TMPRSS2-ETS融合基因可以进一步鉴别IDC-P与HGPIN。