内质网应激调节细胞自噬及其干预动脉粥样硬化的信号通路研究进展

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是多种疾病发生的病理基础，其发病机制是一个涉及多个代谢和信号传导途径的复杂过程[1]，包括内皮细胞功能障碍和血管完整性破坏在内的多种细胞功能障碍，以及炎症细胞数目增加，细胞因子产生，血管平滑肌细胞增殖和迁移，单核细胞和巨噬细胞活化和新血管生成等，最近的研究发现，急性冠脉综合征(ACS)与AS斑块的突然破裂和这些斑块的快速发展有关[2]。内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)与细胞自噬(autophagy)是细胞在不同程度和不同性质的刺激下所产生的为维持细胞内环境稳态的适应性反应，在AS的发生和发展过程中起着重要的调节作用。适度的自噬作为体内潜在的补偿机制，可使细胞免受环境刺激的影响，维持细胞内环境的稳态，延缓AS的进程；而过度自噬则能诱导细胞凋亡，影响斑块稳定。大量研究证实，ERS可诱导细胞凋亡，而细胞为了避免凋亡，激活蛋白酶体途径和细胞自噬，维持细胞稳态，并参与多种生理与病理过程[3]。ERS既可通过对多种因子的调节直接作用于AS，也可激活细胞自噬，从而间接影响AS形成。本文拟从ERS激活细胞自噬从而调节AS的间接作用入手，来探讨ERS对AS的作用机制。

1 内质网应激与细胞自噬

1.1 内质网应激 内质网(endoplasmic reticulum，ER)是与外核膜连续的膜状细胞器[4]，它形成一个相互联系的空间网络，主要负责膜蛋白翻译、蛋白质转录后修饰、维持细胞钙(Ca2+)体内平衡和脂质生物合成[5]。为了满足不同的细胞需求，需要不断的ER转换和调节，自噬在这个过程中起着重要的作用[6]。当机体出现营养缺乏、糖基化改变、钙耗竭、氧化应激、DNA损伤和能量干扰等情况时[7]，蛋白质折叠的生理需求增加会导致错误折叠的蛋白质积聚在ER腔中[8]，即为ERS。应激发生后，通过上调分子伴侣葡萄糖调节蛋白78kDa(glucose regulated protein 78kDa，GRP78)表达、抑制蛋白质合成、加速错误折叠和未折叠蛋白质降解等方式可暂时缓解ERS[9]。同时，ERS激活未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)，而UPR在ERS早期主要是通过清除不能正确折叠的蛋白以及减轻内质网负荷等方式起到恢复细胞生理功能和重建ER稳态的作用。UPR以三种跨膜蛋白的作用为特征，即蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like ER kinase，PERK)、肌醇激酶1(inositol-requiring kinase-1，IRE-1)和活化转录因子(Activating transcription factor 6，ATF6)[10]。在无内质网应激反应时，PERK、IRE1、ATF6分别与GRP78结合，处于无活性状态。当发生ERS时，GRP78与上述3种蛋白质解离，与未折叠蛋白结合，并启动UPR，下调在ER内堆积的未折叠或错误折叠的蛋白质，使ER恢复正常功能，对细胞进行保护[11]。然而，持续或较严重的ERS则触发凋亡信号，则不利于细胞生存。例如，血管平滑肌细胞合成大部分间质胶原蛋白，稳定斑块的纤维帽，但持续的ERS促进了血管平滑肌细胞的氧化应激和钙化[12]。

1.2 细胞自噬 细胞自噬，又称Ⅱ型程序性细胞死亡，是广泛存在于真核细胞内的一种溶酶体依赖性降解途径，同时也是程序化的细胞自我修复过程，当细胞内出现过多或受损的过氧化物酶体、内质网、线粒体等细胞器及异常DNA和蛋白聚集体时，即可通过自噬溶酶体降解途径进行清除以维持细胞的稳态[13]。在自噬过程中，微管相关蛋白1轻链3(LC3)经历一个翻译后修饰以形成脂质化的LC3-Ⅱ，其充当宿主细胞中的自噬体标记[14]。自噬膜的延伸需要两种泛素样蛋白连接系统，其中LC3会从游离型的LC3I转变为膜结合型的LC3-Ⅱ，是识别自噬活化的重要生化标志。同时，GRP78、磷酸化真核翻译起始因子2a(p-eIF2a)、LC3、p53、p62和Beclin-1等的表达通常用于评估自噬。ERS诱导的细胞自噬可通过称为“噬脂”的过程，水解细胞吞噬的脂肪滴，介导胆固醇向胞外的载脂蛋白AI转运，调节细胞胆固醇的代谢和外流，减轻泡沫细胞脂质负荷。若抑制细胞自噬，如敲除ATG5，则可检测到主动脉全段泡沫细胞数量和斑块面积的显著增加[15]。Liao 等[16]通过消融ATG5抑制巨噬细胞中的自噬，促进胆固醇负荷诱导的细胞凋亡和氧化应激，可以导致AS形成，二者结论一致。

2 内质网应激调节细胞自噬的通路和机制

当ER堆积了大量的错误折叠或未折叠的蛋白质时，UPR除了促成细胞凋亡外，还将诱导细胞发生自噬[3]。由于经常在分离膜附近观察到ER，因此被认为是自噬体形成的主要来源之一或自体噬菌体形成的平台[17]。Hamasaki等[18]发现ER膜的片段在饥饿条件下被运送到自噬体。调节自噬水平的ULK1到PI3P效应物的分子，其负责自噬体成核，定位于ER，也表明ER可能是膜源和支架自噬体形成的候选者[19-20]。UPR的下游通路也存在抑制细胞自噬发生的机制，在多种细胞中验证发现，若敲除ERAD(endoplasmic reticulum-associated degradation)过程的脚手架蛋白—同型半胱氨酸诱导的内质网应激蛋白(homocysteine-inducible ER stress protein，Herp)，可检测到细胞自噬调节蛋白Beclin1和 ATG5水平的显著升高，以及细胞在应激下更强的存活能力[21]。动物实验也提到Herp敲除能增加主动脉血管细胞自噬水平，显著延缓斑块进展[22]。但是，ER诱导的自噬是促进细胞生存还是细胞凋亡，依赖于细胞类型，以及应激的强度和持续的时间[23]。马美娟等[24]利用氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)诱导的泡沫化巨噬细胞模型，首次证实小剂量衣霉素可引起的一定程度的内质网应激，同时激活了适度的自噬，从而减少了巨噬细胞的凋亡，可能有助于减轻动脉粥样硬化的进程，并证实了不同程度的ERS会引起不同的自噬效应。

2.1 UPR下游信号通路对AS的作用机制 UPR由3个上游蛋白引发，即IRE1，ATF6和 PERK。IRE1α和PERK均为内质网Ι型跨膜蛋白激酶，属于UPR的近端感受器；ATF6为内质网Ⅱ型跨膜蛋白激酶。尽管在ERS中细胞保护的分子机制尚未得到充分的阐明，但似乎很清楚UPR活化引起的增加折叠能力和减弱的蛋白质翻译可以使细胞消除病原性蛋白质[25]。Gargalovic等[26]发现内皮细胞的UPR活化也可被氧化的1-棕榈酰-2-花生四烯酰-sn-3-甘油磷酸胆碱(oxidized 1-palmitoyl-2-arachidonyl-sn-3-glycero-phosphorylcholine，oxPAPC)诱导，并在晚期动脉粥样硬化病变中发现氧化磷脂。

2.1.1 PERK-eIF2α信号通路 PERK含有磷酸化真核翻译起始因子2a(eIF2a)的细胞质激酶部分，通过磷酸化eIF2α(p-eIF2α)来降低蛋白的整体翻译水平。eIF2α磷酸化稳定了eIF2 / GDP /eIF2β复合物并防止GDP / GTP交换反应。因此，它在连续几轮启动之间损害了eIF2的再循环并导致在ERS早期阶段全面抑制翻译，即暂时性减轻ER未折叠或错误折叠蛋白负荷[27]。PERK-eIF2α信号通路有多个下游基因，如SREBP、ATF4、CHOP等。SREBP是调节胆固醇及脂质稳态的关键转录因子，当ERS激活SREBP后，诱导胆固醇/脂肪酸生物合成和摄取相关基因的表达，引起细胞内胆固醇和脂肪酸的累积，促使脂质代谢异常的进一步恶化[28]，因此PERK-eIF2α-SREBP信号通路激活将导致肝脏胆固醇代谢失调，进一步促进AS的进程。同时p-eIF2α促进了ATF4的合成，其激活UPR转录因子CCAAT /增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)等基因。CHOP在瞬态ER应激期间参与各种校正功能[29]，并调节ATG5的转录，影响自噬体的形成[30]，从而激活细胞自噬。因此，有学者认为PERK /eIF2α/ CHOP是介导与动脉粥样硬化相关的内质网应激的主要信号通路[31]。此外，p-eIF2α还可以上调ATG12，促进LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转化，触发细胞自噬。

2.1.2 IRE1-XBP1信号通路 IRE1α是一种跨膜蛋白，由N末端传感器结构域，单一跨膜结构域和C末端胞质效应子组成，负责蛋白激酶和内切核糖核酸酶活性。在UPR信号通路中，IRE1α是能够调节细胞命运的变应原的关键分子[32]，可促进自噬小泡的形成[33]。Imaizumi 等[34]研究表明，是IRE1而不是PERK将UPR与自噬连接起来。IRE1通过促进XBP1的表达，有助于缓解新生蛋白质与确保蛋白质折叠和组装所需的伴侣之间的生理和病理生理不平衡。XBP1途径促进错误折叠的蛋白质的降解，也可以触发细胞自噬反应。有研究证明，XBP1 mRNA剪接可通过Beclin-1的转录激活参与巨噬细胞增殖、凋亡和自噬[35]。另外，XBP1 蛋白进入细胞核，结合于 ERSE，既可上调 ERS 相关的相关蛋白如GRP78 的表达，也可影响脂质代谢进程[15]。另外，IRE1除了通过与下游的XBP1来激活自噬，还可以通过IRE1-TRAF2-JNK来激活自噬。已有研究证实，毒胡萝卜素诱导的LC3阳性囊泡的积累在TRAF(一种将活性IRE1连接至c-Jun N端激酶活化的胞质接头分子)缺陷的小鼠成纤维细胞中自噬被完全抑制[36]。JNK的药理学抑制剂有效地抑制了其模型系统中的LC3易位，表明IRE1-TRAF2-JNK途径对于用ER应激物攻击的小鼠成纤维细胞中的自噬诱导是必需的[37]。Ogata等[38]也声明ER应激诱导的自噬由IRE1α与TRAF2相互作用调节JNK活化。Xu 等[10]则证明了IRE1α/ XBP1s分支连接缺氧诱导因子1α(HIF1α)活化以介导局部增强的RAS组分和内皮功能障碍，阻断IRE1α/ XBP1s /HIF1α通路激活减弱了PM2.5暴露下的ANGII依赖性内皮功能障碍，并预测寻找新的治疗靶点来缓解内质网应激和恢复局部RAS稳态可能有助于管理PM2.5暴露下的心血管疾病的负担。在AS中，IRE1-XBP1信号通路的激活，还将引起肝细胞脂滴积聚，加速AS进程。

2.1.3 ATF6信号通路 从GRP78解离后，ATF6进入外壳蛋白复合物Ⅱ(COPⅡ)囊泡，靶向高尔基体腔，其中在位点1蛋白酶(S1P)和位点2蛋白酶(S2P)处发生切割。S1P和S2P所需的ATF6加工，即处理SREBPs以响应胆固醇剥夺的酶，证明了ERS和SREBP之间的重要关系[39]。Zeng等[40]报道ATF6拮抗SREBP-2以调节脂质和葡萄糖的稳态，从而影响AS进程。

2.2 Ca2+-CAMKK-β/AMPK信号通路 在哺乳动物细胞中，受ERS诱导，细胞质中的Ca2+作为一个协调者参与调解自噬。Ca2+对细胞自噬的调节主要与mTOR通路有关。在内质网应激的情况下，当Ca2+从内质网释放，细胞内Ca2+浓度升高激活钙调蛋白依赖性激酶-β (calmodulin-depen-dent kinase kinase β，CAMKK-β)，进而激活 AMPK，抑制 mTOR通路，从而上调细胞自噬[41]。Høyer-Hansen等[42]也提出从ER释放的Ca2+通过CamKK / AMPK依赖性途径抑制mTOR途径，从而诱导自噬。据报道，各种Ca2+动员剂如离子霉素、ATP和毒胡萝卜素等抑制自噬的阴性调节因子mTOR的活性，并以Beclin-1和ATG7依赖的方式引起自噬体的大量积累以触发自噬[36]。

2.3 Bcl-2/beclin-1信号通路 B细胞淋巴瘤/白血病2(Bcl-2)是一种抗凋亡蛋白，根据使用的模型系统不同，Bcl-2 对细胞自噬与凋亡的调控也不同。内质网定位的Bcl-2能够与具有BH3 结构域的Beclin-1相结合，抑制Beclin-1 依赖的自噬；另一方面，Bcl-2 可调控PI3K-Akt-mTOR信号转导通路，进而抑制细胞自噬活动[41]。此外，JNK已被证明可以控制beclin-1的表达，从而调节神经酰胺诱导的自噬。据报道，JNK介导的Bcl-2的磷酸化导致其释放Beclin-1，从而使Beclin-1与ClassⅢ PI3K(自噬的正调节因子)结合，从而允许自噬进行[43]。Lee也已经证实，JNK通过Bcl-2磷酸化调节自噬，其阻止该蛋白质与自噬基本调节因子beclin-1相互作用[44]。因此，Bcl-2磷酸化可能不仅是调节自噬和凋亡的机制，而且也是调节两条途径之间转换的机制。

3 小结与展望

动脉粥样硬化性心血管疾病是对人类健康威胁最严重的疾病之一 ，是冠心病和缺血性脑卒中的主要原因。据报道，全球范围内心血管疾病的病死率仅次于肿瘤的病死率，严重危害人类健康[9]。但是，目前尚没有药物在预防斑块进展方面显示出明显的益处[45]。动脉粥样硬化的许多危险因素(例如低密度脂蛋白)在整个循环中均匀地影响内皮细胞，但是动脉粥样硬化的损伤倾向于发生分段，特别是在动脉分支点[46]。ERS既能引起细胞凋亡，也可引起细胞自噬，且自噬与凋亡之间也是可以互相转化的。例如，Bcl-2磷酸化可能不仅是调节自噬和凋亡的机制，而且也是调节两条途径之间转换的机制。可以通过上调或下调ERS下游的自噬相关因子或者凋亡因子来影响晚期AS巨噬细胞等生存与否，从而促进斑块稳定，延缓AS进程。不同程度的内质网应激，也会引起不同的自噬效应。ERS可以通过多途径、多通路来激活自噬，了解这些通路的调节因素和影响因子，并对其进行干预，从而调节细胞自噬。因此，对这些通路和机制的探讨是必要的。但是，目前对该领域的了解我认为还存在以下问题：①对这些通路的信号转导通路、分子机制、调节基因等的研究还不够深入、全面；②大部分研究结果都是基于动物，并不一定能代表人类的机制，且不同动物模型得到的结论也可能不一致；③对这些通路和靶点的研究结论大多还不能有效地运用到实践。在AS病变中，细胞自噬已被证实参与其形成和发展，进一步研究内质网对自噬的调控机制和信号通路，并通过人为干预来对这些分子机制和信号通路进行调节，可能为动脉粥样硬化的预防、诊断和预后提供新的思路。