糖化血红蛋白的检测方法及标准化研究进展

王少婷，刘 倩，于 洋，王 艳，曹永彤⋆

（1.中日友好医院 检验科，北京 100029；2.内蒙古包头市白云鄂博区妇幼保健院，包头 014080）

糖基化红细胞血红蛋白 （glycated hemoglobin，GHb）是国际上公认的可以反映长期血糖水平的金标准。GHb 由于所结合的成分不同，又分为HbAla （与磷酰葡萄糖结合）、HbAl b（与果糖结合）、HbAlc（与葡萄糖结合）。糖化血红蛋白（glycated hemoglobin A1c，HbA1c）在糖尿病管理中是公认的血糖控制金标准[1，2]，也是评价糖尿病治疗方案的有效指标。目前，世界卫生组织（World Health Organization，WHO） 和许多国家的糖尿病学会已将HbA1c 作为独立的糖尿病诊断指标[3]。 由于HbA1c 含量最多，临床上测定的主要是HbAlc[4]。 为避免混淆，国际专家组织建议：GHb 的正规表达为HbA1c，在指南或教育资料中可以使用缩写A1c 描 述HbA1c[5]。

1 HbA1c 在临床中的应用

HbA1c 是人体血液中红细胞内的血红蛋白与血糖结合的产物，血糖和血红蛋白的结合生成HbA1c 是不可逆反应，并与血糖浓度成正比，由于红细胞的生存周期一般为3～4 个月，因此通过观察HbA1c 水平可用于监测患者过去120d 内总体的血糖控制情况。 且HbA1c 测试不受空腹和胰岛素治疗的影响。 因此，糖基化红细胞血红蛋白是一种控制糖尿病患者病情的很好的测定指标，现在国外已将HbA1c 监测作为糖尿病疗效判定和调整治疗方案的“金指标”[6]，还是WHO 推荐的糖尿病诊断标准[7]。

2010 年，ADA 对国际专家委员会的建议给予了充分肯定，在其《2010 年糖尿病诊疗指南》及同期发布的《糖尿病诊断和分布》 中均正式确定将HbA1c 作为糖尿病诊断的一种方法[8]。

GA 是血清白蛋白的非酶糖基化产物，可反映2～3 周的血糖平均水平。 研究表明[9]：糖化白蛋白（glycated albumin，GA） 能客观的检测出患者近期血糖的波动情况，具有较好的及时性和准确性，GA 在对2 型糖尿病治疗效果判断上优先于HbA1c。 虽然GA 可以替代HbA1c 评估平均血糖水平，且检测方便、快捷，但目前在糖尿病随诊中GA控制标准、GA 对糖尿病并发症的预测价值等领域尚缺乏类似HbA1c 的临床研究证据，GA 的临床应用价值和HbA1c 比较仍有差距[10]。

HbA1c 作为评价糖尿病患者长期血糖控制情况及糖尿病并发症的重要指标，它的检测方法和试剂厂家繁多，各医院实验室操作人员水平参差不齐，导致实验室之间检测结果偏倚较大。 现将HbA1c 的主要检测方法、国际标准化计划的进展、 我国HbA1c 参考体系建立的现状及临床应用进行阐述。

2 HBA1c 的检测方法

目前，HbA1c 的测定方法较多，方法不同监测结果可能会有较大的差异，常用的方法有高效液相法、微柱法离子交换层析、免疫法、电泳法、酶法等。 美国临床化学协会（AACC）HbA1c 标准化分会和IFCC HbA1c 标准化工作组建议，将高效液相法（HPLC）作为检测HbA1c 的金标准[11]。

2.1 离子交换层析法

其检测原理是基于GHb 和非GHb 所带电荷不同进行分离。 应用弱酸性阳离子交换树脂，在一定低浓度洗脱液和接近中性pH 条件下，HbA1c 末端缬氨酸糖基化后几乎不带正电荷，首先被洗脱。 非糖基化的HbA 带正电荷，被高浓度洗脱液洗脱。因此可通过此方法将其与其他组分区分开[12]。此方法血液样本可用EDTA 和肝磷脂处理[13]。常用的离子交换层析法主要有高效液相色谱法 （HPLC），低效液相色谱法（LPLC）和手工微柱法。 其中高效液相色谱法具有分离效率高、抗干扰能力强的特点，能够降低血红蛋白变异体对HbA1c 检测结果的干扰。HPLC 法对全血直接测定HbA1c 其批内和批间变异系数CV 均可以<1%（CV<1%），结果精确。 此方法测定HbA1c 具有操作简单，快速，准确的特点，对于长期保存的标本依然具有很好的稳定性[14]。此方法曾应用于美国DCCT 的研究，是目前检测HbA1c 的金标准。 但环境温度、 缓冲液的离子强度和pH对测定结果影响较大。此方法最大的缺点是实验所用仪器及试剂、耗材昂贵，难以在基层医院推广普及[15]。

2.2 电泳法

电泳法的原理是基于胶体颗粒在一定条件下带有不同电荷，带有电荷的胶体颗粒可以借静电吸引力在电场中泳动。血红蛋白结构不同，所带的电荷情况也不同，在琼脂糖凝胶上的电泳迁移速度也不同，血红蛋白经琼脂糖电泳后，距离阴极端最近的是含糖基最少的HbAl 和HbAlb，处于中间部分的是HbA1c，距离阳极端最近的是Hb 的主要成分HbA0。 通过光密度仪扫描计算，最终得HbAlc 的百分含量。 该方法样本用量少，分辨率高，重复性较好。 可发现异常Hb，异常Hb 的存在可使HbA1c 假性增高[16]，但电泳法速度比较慢，自动化程度低，急诊插入、自动维护等功能比较欠缺，无法进行实时检测，目前尚无商品化、具有批量样本通过能力的仪器面世，因此该法现已少用于临床，主要用于HbA1c 研究。

2.3 免疫法

免疫法的原理是以血红蛋白β 链N 末端最初的4-8个氨基酸残基作为抗体识别位点，制备相应的单克隆抗体，HbA1c 与相应的单克隆抗体结合发生凝集。 其测定方法相对成熟，结果准确性好。

2.3.1 离子捕获法

其原理是GHb 与相应抗体结合后，联结荧光标记物，形成反应复合物，再联结带负电荷的多聚阴离子复合物，而在IMX 反应孔中的玻璃纤维预先包被了高分子的四胺合物，使纤维表面带正电，前述的反应复合物吸附在纤维表面，经过一列清洗后测定其荧光强度，从而得到GHb 的浓度，该方法灵敏度和特异性高，重复性好，自动化程度高，回收率可达98.85%，交叉污染率低于0.01%，适用于成批GHb 样本的检测[17]。但是该方法受样本浓度影响，高浓度样本检测结果偏低，这与抗体浓度不能达到相关高度有关，需要稀释；还有HbS、HbC、HbE 和HbF 等变异血红蛋白可影响检测结果。

2.3.2 免疫凝集法

是一种利用HbA1c 与相应的单抗结合进而发生凝集反应，通过测定吸光度直接测定总Hb 中HbA1c 百分含量的方法。 该方法不用购置专门的仪器，可在全自动生化分析仪上进行测定，因而节约了实验室成本，适合于成批的样本检测。但该方法易受脂肪血、黄疸等样本因素影响，抗交叉污染较差，而且要求血红蛋白在一定范围之间才能达到较好的线性。

2.3.3 化学发光法

采用离子捕捉免疫分析法，应用抗原抗体反应原理，联以荧光标记物。 通过连接带负电的多阴离子复合物，吸附到带正电的纤维表面。 经过一系列彻底清洗等步骤后，测定荧光强度变化率计算浓度。该法检测系统易于规范和重复，可减少操作技术误差，检测的灵敏度和特异度高，批内、批间变异系数小，回收率和准确度高，交叉污染率小，影响因素少，但由于需采购专用试剂包和免疫发光分析仪成本昂贵，因此仅适用于大批量样本检查[18]。

2.3.4 酶法

酶法的原理是变性后的血标本经蛋白酶消化，糖基化的缬氨酸释放出来，作为底物果糖缬氨酸氧化酶（FVO）的氧化产生H2O2，H2O2在辣根过氧化物酶的作用下与特定的色原耦联[19]。 酶法检测HbA1c 在低值可检测范围比HPLC 法更低，而在高值可检测范围也比HPLC 法低。

2.4 床旁检测（point of care testing，POCT）方法

虽然临床上使用方便，也成为HbA1c 检测发展的重要趋势，但其分析性能（正确度和精密度）普遍不及实验室检测仪器，由于HbA1c 个体内生物变异小，并与糖尿病微血管并发症密切相关，因此测定精密度是评价仪器性能的关键指标之一，也是多数POCT 仪器HbA1c 测定结果不能满足糖尿病诊断和监测要求的主要原因[20]。

3 HbA1c 检测标准化现状及进展

HbA1c 作为糖尿病首选的诊断标准，又是糖尿病筛查以及血糖控制的“金标准”，测定结果的准确性直接关系到糖尿病患者的干预和血糖控制不同的检测原理、测定方法可以得到不同的HbA1c 的测定值，加上变异Hb（HbS、HbC、HbE 和HbF）的影响，使得测定结果的准确性、重复性以及各实验室之间结果有较大差异，根本谈不上可比性。而诊断指标要用于临床，首先要可比，而解决可比性的关键在于量值溯源。因此其测定结果具有溯源性和可比性非常重要。 如何建立一个国际公认的，结果可以互相比对的HbA1c 分析体系越来越受到临床重视。

3.1 国际标准化进程

HbA1c 的标准化工作可以分为两个阶段：第一个阶段是以美国、瑞典、日本为代表的国家、地区标准化，第二个阶段是国际临床化学与医学实验室联盟（International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine，IFCC）的全球标准化。

为了HbA1c 检测结果的一致性，早在1984 年Petcrson等就首次提出HbA1c 检测标准化的问题，并对实验室间不同检测方法的相关性和重复性进行了评估。 直到1993年，糖尿病控制与并发症试验（Diabetes Control and Complications Trial，DCCT）研究结果发表后，美国临床化学协会 （American Association for C1inical Chemistry，AACC）建议所有HbA1c 检测结果的单位应与DCCT 单位一致，进而催生了美国HbA1c 标准化计划 （National Glycohemoglobin Standardization Program，NGSP），于1996 年完成。NGSP 参考系统是以DCCT 数值为基础，把NGSP 参考实验室网络中各种实验方法都校准为DCCT 参考方法，并建议各实验室只能采用被NGSP 认可的方法来检测HbA1c使临床实验室的检测结果与DCCT 的检测结果更具有相关性，大大减少了各实验室之间的差异。

国际上有3 个HbA1c 国家标准化项目：美国的国家HbA1c 标准化计划（National Glycohemoglobin Standardization Program，NGSP），日本糖尿病学会与日本临床化学协会的联合计划 （Japanese Diabetes Society/Japanese Society for Clinical Chemistry，JDS/JSCC 以 及 瑞 典 的Mono-S in Sweden 计划[21]。 其中最为“著名”的是NGSP。

国际临床化学与检验医学联合会（International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine，IFCC）在1995 年成立了HbA1c 标准化工作组，旨在建立国际公认的检测HbA1c 参考方法和参考物质，并于2002 年正式发表了HbA1c 的参考测定体系，同时制备HbA1c 和HbA0 的纯物质参考物质，实现了计量学上向国际单位制SI 溯源。 随后又统一了HbA1c 的命名和单位。 至此，经历了各国的标准化及全球标准化两个不可分割的阶段，最终实现了HbA1c 测定的全球可比性。

2003 年，美国99%的实验室HbA1c 检测结果都能溯源到DCCT，ADA 在糖尿病诊疗指南中推荐HbA1c 作为监测血糖控制的“金标准”正是基于此结果[22]。 2007 年，美国糖尿病组织、欧洲糖尿病研究学会、国际糖尿病联盟和IFCC 等学术组织在意大利举办了首次HbA1c 检测标准化共识会议，发表了“HbA1c 检测全球化联合声明”，确定了IFCC 的参考系统是唯一能够满足标准化要求的方法，并由此衍生出NGSP 单位（%）。 2010 年．再次发表联合声明：HbA1c 检测必须在世界范围内标准化，包括参照系统和数值报告。

IFCC HbA1c 标准化工作组还组建了参考实验室网络，截至2014 年10 月底，该网络已包括16 个获认证的参考实验室和3 个候选实验室，每个实验室运行1～2 种IFCC 参考方法。

3.2 中国HbA1c 标准化的现状及局限

尽管国际上HbA1c 检测标准化工作已经进行了很多年并达成了共识，但是由于HbA1c 检测受多种因素影响，我国HbA1c 测定标准化工作仍然处于起步阶段，在精密度和准确性方面与发达国家相比仍存在较大的差距，一般CV 仍在7%～10%[23]，与5%的国际标准存在较大差距，这无疑阻碍了HbA1c 作为诊断指标应用于临床。

在2011 年之前，由于没有国家标准，国内开展HbA1c实验室检测现状很不理想，各实验室采用的HbA1c 检测系统很多，甚至很多实验室仍在采用非标准化的方法，缺乏相关的参考实验室网络及正确性验证的途径，结果可比性不容乐观。 2011 年1 月，由复旦大学附属中山医院潘柏申教授牵头，与上海交通大学附属瑞金医院内分泌代谢病研究所和上海交通大学附属第六人民医院糖尿病研究所3 家具有NGSP 资质的实验室共同组织了上海地区HbA1c一致性计划。 这项工作为中国HbA1c 标准化工作提供了宝贵经验。

目前在中国，绝大部分医院均开展了HbA1c 检测项目，多种检测方法在中国均有使用，但不同方法之间的一致性不理想，某些HbA1c 试剂没有成熟的标准化认证，只能取各医疗机构检测结果的平均值作为标准进行评价，但纳入的实验室数量严重影响评价标准。 但我国对HbA1c检测方法的标准化的重视正在日益提高，HbA1c 参考体系已基本建立。 2011 年6 月国家食品药品监督管理局组织制定的《HbA1c 分析仪》医药行业标准通过专家二审讨论。卫生部临床检验中心按照IFCC 参考体系建立了国际公认的HbA1c 一级参考方法，并制备了3 个浓度水平的标准物质，参考测量实验室认可工作也在进行中。 该标准的发布和实施结束了我国HbA1c 检测方法上市不统一，无章可循的状态。 NCCL 参考方法于2013 年12 月底通过CNAS ISO 17025 校准实验室的认可。 在2014 年常规HbA，室间质量评价（external quality assessment，EQA）中，我们采用IFCC 参考方法确定指定值，取代了以往采用组内中位数作为指定值的做法。

2017 年，召开项目启动会、成立全国HbA1c（HbA1c）专业委员会，分别在青海省、四川省、江西省、云南省、宁夏自治区开展省级标准化工作会议；2018 新年伊始省级标准化工作会议在陕西省、广东省、安徽省陆续拉开，计划全年在全国持续推进，覆盖约50 个城市。截止目前已开展的8 个省份成立了“HbA1c 标准化工作组“，为各省HbA1c 标准化工作奠定了坚实基础，随着项目在全国各地深入开展，将有更多专家、学者参与其中，将大大加快中国HbA1c标准化工作步伐。

4 展望

从检验方法方面来说，所有的检测方法都不是十分完美，都有着自己的缺点，相信随着对HbAlc 实验方法不断改进，HbAIc 的更多新的检测方法可以在临床上广泛应用，为患者造福。

从标准化角度来讲，在我国，整合和开发现有资源，积极开展HbA1c 测定的一致性和标准化工作，因此在HbA1c 标准化的道路上，仍需加快步伐。相信在各方持续、有效的共同努力下，将不断提高HbA1c 的测定质量，以适应HbA1c 临床应用发展的需要，更有效地运用HbA1c 以推动糖尿病防治工作的发展，充分发挥其作用。