高效液相色谱法测定不同产地山海螺中党参炔苷的含量及指纹图谱

王景雁，马秉智，兰 颐，王海洋，李 栋，赫 军，陆 进，刘 晓⋆

（1.中日友好医院 药学部，北京 100029；2.北京中医药大学 中药学院，北京 100102；3.山东达因海洋生物制药股份有限公司，威海 264300）

山海螺为桔梗科植物羊乳Codonopsis lanceolata（Sieb.et Zucc）Trautv 的干燥根。 味甘性温，归心、肺经，功能益气养阴、解毒消肿、排脓、通乳。 用于神疲乏力、头晕头痛、肺痈、疮疖肿毒、喉蛾、瘰疬、产后乳少、白带、毒蛇咬伤[1]。 现代药理学研究表明，山海螺具有耐缺氧和抗疲劳[2，3]及增强免疫的作用[4]，镇静、镇痛、抗惊厥和提高记忆力的作用[5]，抗肿瘤作用[6]，抗炎、抗菌和镇咳作用[7]，抗氧化[8，9]，催乳作用[10]，抗突变活性和调节血脂作用[11，12]，保肝醒酒作用[13]。笔者通过前期实验研究发现，山海螺药材中党参炔苷含量很高[14]，而且同属植物党参也以党参炔苷作为质控指标[15]，故本文以党参炔苷作为质控指标，采用高效液相色谱（HPLC）法测定了13 个不同产地山海螺样品，为山海螺的质量控制提供科学依据，现将结果报告如下。

1 材料

1.1 仪器

Agilent1260 高效液相色谱仪 （包括DAD 检测器，四元高压梯度泵，自动进样器、柱温箱，美国安捷伦公司）；Sartorius CPA225D 型电子分析天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司）；KQ-300DE 型数控超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；DT5-3 型低速自动平衡离心机（北京时代北利离心机有限公司）；HH-S4 型电热恒温水浴锅 （北京科伟家兴仪器有限公司）。

1.2 药材与试剂

山海螺样品产地见表1，鉴定为桔梗科植物羊乳Condonopsis lanceolata （Sieb.et Zucc.）Trautv.的干燥根。 党参炔苷对照品（中日友好医院自制，纯度≥99%），乙腈为色谱纯（美国Fisher 公司）；甲醇为分析纯；水为高纯水。

山海螺供试品由中日友好医院门诊中药房提供（购自北京鹤延龄药业发展有限公司，产地：河北，批号：140941）

2 方法与结果

2.1 不同产地山海螺中党参炔苷的含量测定

2.1.1 色谱条件

色 谱 柱：Agilent Eclipse plus C18 （4.6mm×100mm，3.5μm）；流动相：乙腈-水，梯度洗脱50min（以乙腈比例表示），0～30min（5%～35%），30～50min（35%～100%）；流 速：1.0ml/min；检测波长：210nm；柱温：30℃；进样量10μl。 色谱图见图1。

2.1.2 对照品溶液的制备

精密称取党参炔苷对照品10.14mg，置于50ml 量瓶中，用甲醇溶解并定容，摇匀，即得。

2.1.3 供试品溶液的制备

称取山海螺样品粉末5g（河北，过六号筛），精密称定，置于100ml 锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，称定质量，超声处理30min（频率100kHz，温度40℃），冷却至室温，用甲醇补足减失的质量，离心，取上清液，水浴蒸干，加甲醇溶解，定容至25ml，经0.45μm 微孔滤膜滤过，即得。

2.1.4 空白对照品溶液的制备

精密移取甲醇50ml，置于100ml 三角瓶中，按供试品溶液的制备方法制成空白对照溶液。

2.1.5 线性关系考查分别精密移取对照品溶液1μl、5μl、10μl、15μl、20μl，注入液相色谱仪，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。 以质量浓度（x，μg/ml）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标绘制标准曲线，得到党参炔苷的回归方程为y=37.067x+20.901（r=0.9999）。 结果表明，党参炔苷质量浓度在10.1～202.0μg/ml 范围内与峰面积具有良好的线性关系。

2.1.6 其它方法学考查

图1 HPLC 图（1-党参炔苷）

表1 样品产地、含量测定及HPLC 指纹图谱相似度分析结果（n=3）

表2 精密度、稳定性、重复性实验结果（n=6）

表3 加样回收率实验结果（n=6）

表4 精密度、稳定性、重复性实验结果（n=6）

按“2.1.1”项下色谱条件，分别考查精密度、稳定性、重复性、加样回收率，结果分别见表2 和表3。

2.1.7 样品含量测定

分别称取13 个不同产地的山海螺样品5 g （过六号筛），精密称定，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，以外标法计算样品中党参炔苷的含量，结果见表1。

2.2 不同产地山海螺HPLC 指纹图谱

2.2.1 色谱条件

同山海螺含量测定“2.1.1 ”项下色谱条件。

2.2.2 对照品溶液的制备

同山海螺含量测定“2.1.2”项下对照品溶液的制备。

2.2.3 供试品溶液的制备

同山海螺含量测定“2.1.3”项下供试品溶液的制备。

2.2.4 其他方法学考查

取S5 号山海螺样品，按照“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1.1”项下色谱条件，分别考查精密度、稳定性、重复性，经国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2004A 版）进行评价，结果见表4。由结果可知，精密度、稳定性、重复性良好。

2.2.5 山海螺样品测定

取13 个产地山海螺样品，分别按照“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，再按照“2.1.1 ”项下色谱条件进样分析，记录50mim 色谱图。 根据样品溶液HPLC 提供的相关参数，确定山海螺共有峰为18 个，见图2。

2.2.6 指纹图谱相似度计算

图2 不同产地山海螺HPLC 指纹图谱及对照图谱R

将13 个样品的色谱图导入国家药典委员会 《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2004A 版），设定样品S5 为参照图谱，采用中位数法计算，进行数据匹配，选取“时间窗宽度”为0.1min，进行谱峰自动匹配。 结果见图2 和表1，由结果可知，13 个样品的指纹图谱与对照指纹图谱的相似度在0.848～0.994 范围内。

3 讨论

山海螺的质量标准研究，黄昌杰[16]、王文永[17]采用HPLC 法测定了山海螺中紫丁香苷的含量，武佳等采用HPLC 法测定了四叶参中四叶参皂苷的含量[18]，赵燕燕等采用HPLC 法测定了泰山四叶参的指纹图谱[19]，陈恒冲[20，21]用薄层色谱（TLC）法鉴别轮叶党参药材，以高效液相色谱（HPLC）法测定药材中轮叶党参皂苷的含量；又采用高效液相色谱法测定了东北地产轮叶党参的指纹图谱。综合分析，上述文献中没有以党参炔苷作为质控制指标的，而且用于山海螺指纹图谱研究的样品产地也有限，因此，笔者将党参炔苷作为山海螺的质控指标，采用HPLC 法测定13个不同产地山海螺中党参炔苷的含量及指纹图谱，是很有意义的。该方法简单，重复性好，可作为山海螺的质量控制方法，为山海螺的质量控制提供了一定的依据。 通过测定13 个不同产地山海螺中党参炔苷的含量可知，不同产地的样品差异较大，其中，安徽六安的含量最高，广东茂名的含量最低，分析其原因，可能与产地、采收季节、生长年限、是否野生有关，但具体原因有待进一步研究。

供试品溶液的制备方法，本文考察了超声法、回流法、煎煮法3 种提取方法，结果发现，超声法与回流法、煎煮法提取效率无显著差异，但超声法操作简便，可控性强，故选择超声提取法； 然后笔者对超声提取时间（15、30、45min）进行了考察，结果发现，30min 和45min 提取效率无显著性差异，均高于15min，，故选择超声提取时间30min；最后笔者简单地对提取溶剂（甲醇、水）进行考察，发现甲醇的提取效率远高于水，故选用甲醇为提取溶媒。

检测波长的选择，笔者考察了210nm、254nm、280nm、320nm、380nm 共5 个检测波长，结果发现，210nm 时山海螺HPLC 色谱图中各色谱峰面积较大且分离度良好，故检测波长选择210nm。