循环肿瘤细胞在前列腺癌的诊断治疗及预后中的作用

陈 凯 孙忠全

复旦大学上海医学院附属华东医院泌尿外科（上海 200137）

世界范围内，前列腺癌是男性第二大恶性肿瘤以及第五大肿瘤相关性死亡原因[1]。前列腺癌初诊时绝大多数是激素敏感型前列腺癌，因此，初诊的此类前列腺癌患者主要采用内分泌治疗，包括去势（手术去势或药物去势）及抗雄激素治疗等，但是相当一部分患者在经过雄激素剥夺治疗后终将进展为转移性去势抵抗性前列腺癌 （metastatic castration-resistant prostate cancer,mCRPC）。近年来随着新型内分泌治疗药物如阿比特龙及恩杂鲁胺等的问世，mCRPC患者预后得到很大改善[2]。PSA是前列腺癌诊断、治疗及预后判断过程中最常用标记物之一，而当肿瘤Gleason评分较高或患者进入CRPC阶段时，PSA值有时却和肿瘤负荷及影像学表现不成正比[3]，因此，传统的PSA检测已不能满足对此类前列腺癌尤其是接受新型内分泌治疗的患者进行预后的预测和评估。近年来随着精准医学的开展，能否找到前列腺癌更好的预测和预后判断指标，成为了当下热点问题。

一、循环肿瘤细胞

循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）是指从肿瘤自发脱落或在诊疗操作过程中进入外周血液循环的完整肿瘤细胞，它来源于原发灶或肿瘤转移灶。现已证实其是肿瘤血行转移的重要机制之一[4]。一项由Cristofanilli等进行的研究证实转移性乳腺癌的患者中，治疗前每7.5mL外周血中检测到5个及以上的CTCs的患者相比外周血中检测到小于5个CTCs的患者，中位总生存时间（median overall survival,OS）以及中位无进展生存时间 （median progression-free survival,PFS）更短，且差异有统计学意义[5]，这项研究第一次揭示了CTCs的检测对预测恶性肿瘤的转移和预后是具有一定价值的。近年来随着检测技术的进展，CTCs已应用于临床多种恶性肿瘤（乳腺癌、肺癌、前列腺癌、结直肠癌等）的分期评估及疗效评价[6,7]。

二、循环肿瘤细胞的检测及富集技术

目前外周血循环肿瘤细胞的检测技术超过30余种，它们分别具有不同的灵敏度、特异度及可重复利用度[8]，主要包括以聚合酶链式反应（PCR）为基础和以免疫学为基础的两大类检测方法，前者敏感性较高，通过对从血浆或尿液样本中分离出的核酸进行分析，发现癌细胞在基因组水平和转录水平的改变，这一方法不一定要求提取肿瘤细胞，并且可以对癌症发展和治疗过程中发生的变化进行实时的检测[9-12]，但该方法不能区分活细胞、死细胞及循环分子等；后者主要检测细胞分子的表面标记物，具有直观及可被量化的优点，但其无法辨别产生内在变异的肿瘤细胞[13]，该方法往往缺乏一套标准操作流程及规范化的反应试剂,而且价格昂贵。

目前较为成熟的CTC分离及富集技术主要建立在外周血出现上皮来源的肿瘤细胞这一病理现象的基础上，通过监测上皮细胞表面表达的特异性抗原如细胞角蛋白（CK）、上皮细胞黏附分子（EpCAM）等对CTC进行分离和识别。CellSearch细胞筛选技术是以免疫学为基础的，是目前美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration,FDA）唯一批准的用于检测CRPC患者外周血CTC的技术，它正是利用检测EpCAM等上皮细胞表面抗原的表达来鉴定和富集CTC细胞。但CTC有时存在基因变异而不表达特异的细胞表面抗原，因此仅通过生物化学的检测方法常常会造成CTC的分离遗漏。

近年来，通过生物物理学方法检测CTC成为研究的热点，研究发现CTC细胞通常比循环中的白细胞拥有更大的体积和更小的细胞弹性[14]，通过比对循环肿瘤细胞与血白细胞在细胞大小及细胞形态方面的差异，可将CTC进行分离（尽管CRPC患者的CTC有时并不比白细胞的体积大[15]）。基于此原理，如今科学家们已开发出能使单个细胞通过的滤过膜结构，这类新型的微流体装置及微滤过装置的使用将极大推进生物物理学技术在CTC检测中的应用及发展[16]。

也有学者提出通过密度梯度离心分离并富集CTC等多种方法。以上这些方法可以联合应用，Myung等通过对癌细胞的多重表面标记物的优化整合，在细胞滤过膜的基础上，设计出了一种新的多重CTC检测的方法，其检测指标包括EpCAM，表皮生长因子受体（EGFR-2）以及和PSA相结合等，这对外周血中数量稀少的CTC及具有高度异质性的CTC的识别或许具有重大意义[17]。

三、CTC计数与转移性去势抵抗性前列腺癌的预测与预后

目前CTC检测主要应用于晚期前列腺癌，特别是mCRPC的诊断及预后判断。日本的一项多中心研究发现，在CRPC患者中，外周血高CTC计数常常与患者的碱性磷酸酶ALP≥正常值上限（P=0.003），血红蛋白水平＜11.5 g/dl(p=0.021),PSA≥35 ng/mL(P=0.032)及Gleason score为9～10(P=0.025)等存在相关性，并且同时具有骨和淋巴结转移的患者治疗前中位CTC计数显著高于仅有骨转移的患者(P=0.007)。并且外周血基线CTC数量和患者预后相关，外周血基线CTC计数≥5个/7.5mL的患者比少于5个的患者OS明显缩短（10.5个月vs 25个月）,其次ALP高于正常值上限也是OS更短的独立预测因素。在经过3个周期的多西他赛化疗后，患者CTC计数＜5个/7.5mL提示OS改善（P＜0.003）。根据治疗前以及治疗后CTC计数，以5为分界值，将患者分为4组，可以发现三个周期多西他赛化疗后CTC计数≥5个/7.5mL的患者，不论其治疗前外周血CTC计数是否≥5个/7.5mL，患者的中位OS均显著少于治疗后外周血CTC计数＜5个/7.5mL的患者。该篇文章结论指出：3个周期的多西他赛化疗结束后外周血CTC计数对化疗效果及疾病结局的预测具有重要意义，而化疗前患者外周血CTC计数≥5个/7.5mL的患者，往往预示着癌细胞的扩散及化学治疗以失败告终[18]。

此外，也有研究发现，以5个/7.5mL为临界值的CTC计数比PSA具有更好的预测总生存时间的价值，CTC计数受试者工作曲线下面积明显大于PSA下降30%组的曲线下面积 （area under the cure，AUC，81%～87%vs 58%～68%），即CTC计数是CRPC患者总生存时间较为精确和独立的预测因素[19]。Lorente等集中研究了486例前列腺癌患者，这些患者的共同特点是基线CTC计数≥5个/7.5mL外周血，其中122例患者参与了IMMC-38研究 （多西他赛化疗），364例患者参与COU-AA-301研究 （阿比特龙用于化疗后mCRPC患者），在这486例患者中分别有440例，380例，351例在第4周，第8周，第12周接受外周血CTC计数的检测，单变量和多变量分析结果显示在研究的3个时间节点CTC计数较基线值下降≥30%的患者往往有更好的生存获益。（4周 HR 0.45,95%CI 0.36-0.56，p＜0.001；8周HR 0.41,95%CI 0.33-0.53，p＜ 0.001；12 周 HR 0.39,95%CI 0.3-0.5，p＜0.001）。 并且治疗后 CTC 计数较基线下降≥30%与患者生存获益之间的关系与基线CTC计数的多少无关。这说明CTC计数较基线水平下降30%以上，往往提示患者预后较好。因此外周血CTC计数的动态监测可能对患者接受治疗后的疗效评价及预后判断是有所帮助的[20]。

四、CTC细胞表面标记物在前列腺癌诊疗过程中的作用

晚期前列腺癌患者往往外周血中能不同程度地检测到上皮来源，间叶来源或者上皮间叶化生的循环肿瘤细胞。研究证实前列腺癌患者的转移风险很大程度上可以由血清PSA水平结合外周血上皮间叶化（epithelial to mesenchymal transition，EMT）的循环肿瘤细胞数来预测。EMT的特征有细胞黏附分子(如E-钙黏蛋白、EpCAM)表达的减少、细胞骨架从细胞角蛋白（CK）为主转化为波形蛋白（Vimentin）为主、N-钙黏蛋白的表达上调以及形态上具备间充质细胞特征等[21,22]。通过EMT，上皮细胞失去了细胞极性，失去与基底膜的连接等上皮表型，获得了较高的迁移与侵袭、抗凋亡和降解细胞外基质的能力，是上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞获得迁移侵袭能力以及耐药的重要生物学机制[23,24]。Elzbieta Stankiewicz等通过原位杂交技术（m-fish）检测前列腺癌患者外周血中具备EMT的循环肿瘤细胞，并结合血清PSA水平预测转移风险，与单纯运用血清PSA水平评估进行对比，研究结果显示表达CK-/VIM+/CD45-的CTCs常与更高的肿瘤负荷、进展及不良预后相关；表达CK+/VIM+/CD45-的CTCs计数预测肿瘤转移风险的可信度高于表达其他分子类型的循环肿瘤细胞，尤其是结合PSA水平进行综合评估时(AUC 0.921，95%CI:0.858-0.985)[25]。

表皮生长因子受体（EGFR）是一种跨膜糖蛋白，具有络氨酸激酶的活性，其与表皮生长因子（EGF）结合后，经过一系列信号转导通路可启动细胞核内有关基因的表达。其在恶性肿瘤细胞的增殖，迁移等过程中均发挥着重要的作用。研究发现癌症患者肿瘤组织中往往存在EGFR的高表达，并且通常与疾病的进展及不良预后有关[26]。Takatsugu Okegawa等通过免疫荧光技术检测CTC细胞表面EGFR的表达，在多西他赛化疗前外周CTC计数≥5的CRPC患者中（n=37），有15例病人（40.5%）的CTC为EGFR表达阳性，通过与EGFR表达阴性的患者进行比较对照，发现阳性组的患者相比阴性组的患者具有更短的OS（5.5个月vs 20.0个月),且EGFR表达阳性的CTC或许是多西他赛化疗后患者 OS更短的独立预测因子（P＜0.01）[27]。

此外，研究也发现循环巨核细胞计数增多与晚期前列腺癌患者的生存率呈正相关 (HR 0.849,95%CI:0.628-1.146,per cell increase)，而间叶来源的CTCs与循环巨核细胞数量的差值与晚期前列腺癌患者的生存率呈负相关 (HR 10.17,95%CI:2.164-47.789,if score≥2.0)[25]，可以看到循环巨核细胞的检测或许会为预测肿瘤进展及预后开辟新的道路，因此将循环巨核细胞与CTCs联合进行检测，是否能够更为准确地预测前列腺癌患者的预后，这值得进一步去探讨。

五、CTC中雄激素受体剪切变异体7基因的检测在前列腺癌诊疗过程中的作用

近年来随着精准医学及分子医学的发展,肿瘤细胞及CTC细胞内与癌变相关的基因检测越来越得到重视，亦成为单纯外周血CTC表面分子标记物（免疫学）检测的有利补充。研究发现，去势敏感性前列腺癌进展到CRPC涉及到AR轴的重新激活，这一过程涉及到CYP17的上调、AR基因的扩增、AR的剪接变异体的表达或者是AR受体本身的变异等[28]。睾酮合成的关键酶是细胞色素酶P450 17 A1（CYP17 A1），睾酮转换为双氢睾酮后和雄激素受体（androgen receptor,AR)结合而发挥效应。近年来，针对mCRPC出现了许多新的治疗药物，包括恩杂鲁胺、阿比特龙、多西他赛、卡巴他赛、Sipuleucel-T及镭-223等，这些药物均能显著改善患者的OS[29-33]，其中阿比特龙是CYP17 A1的抑制剂，而恩杂鲁胺是双氢睾酮的竞争性抑制剂。Antonarakis等利用 AlereTM CTC AdnaTest技术分离 CTC，并利用RT-PCR技术分析AR-V7基因的表达，在31例接受阿比特龙治疗的mCRPC患者中，AR-V7阳性患者的PSA缓解率为0，而AR-V7阴性患者的PSA缓解率为68%(P=0.04)；AR-V7阳性患者的平均PSA无进展生存时间是1.3个月，而AR-V7阴性患者的平均PSA无进展生存时间是5.3个月（P＜0.01）。在31例接受恩杂鲁胺治疗的mCRPC患者中得到了类似的结果，因此AR-V7被认为可以用来预测mCRPC患者对新一代内分泌药物如阿比特龙和恩杂鲁胺的治疗是否具有敏感性[34]。Seitz等将AR-V7水平及其他临床变量（如是否进行阿比特龙及恩杂鲁胺的预治疗、ECOG评分，是否有内脏转移等）与阿比特龙和恩杂鲁胺治疗后患者PSA应答（PSA下降≥50%）进行多变量回归分析，发现只有AR-V7水平与PSA应答之间的关系有统计学意义，全血中高AR-V7水平是新型内分泌治疗后PSA无应答的独立预测因子（P=0.03）。AR-V7基因高表达与更短的PSA无进展生存时间（PSA-PFS）(中位2.4个月vs 3.7个月；P＜0.001),更短的临床PFS(中位2.7个月vs 5.5个月；P＜0.001),更短的OS(中位4.0个月vs 13.9个月；P＜0.001)明显相关。多变量回归分析进一步显示AR-V7高表达是更短的PSA无进展生存时间（HR 7.0,95%CI 2.3-20.7）、更短的临床无进展生存时间（HR 2.3,95%CI 1.1-4.9；P=0.02）、更短的总生存时间 （HR 3.0,95%CI 1.4-6.3；P=0.005）的独立预测因子[35]。

六、结论

综上所述，外周CTC检测在早期局限性前列腺癌患者中阳性率较低，这可能与目前CTC检测技术的局限性有关。目前关于前列腺癌与CTC监测的研究主要集中在晚期前列腺癌，尤其是转移性去势抵抗性前列腺癌。CTC的监测在mCRPC中的应用得到了较多的证据支持，可用于预测CRPC患者的疾病进展、转移风险、总生存期等。近年来随着精准医学的发展，对CRPC患者外周血CTC检测已不仅仅局限于循环肿瘤细胞的表面抗原标记物，多项研究从CTC的基因及细胞内分子层面开展了对前列腺癌的研究，其中以雄激素受体剪切变异体7基因表达（AR-V7）最具代表性。AR-V7的表达检测可以帮助判断CRPC患者对新一代内分泌治疗药物如阿比特龙及恩杂鲁胺治疗是否具有敏感性，从而为精准治疗提供帮助。作为比PSA更为敏感的预测因子，CTC检测可以显著缩短前列腺癌药物临床试验的周期[36]，这在一定程度上可以减轻患者的痛苦及负担。此外，也有学者提出杀死及清除前列腺癌患者循环中的CTC或许会成为一种全新高效的治疗前列腺癌的手段[37,38]。

虽然CTC检测在前列腺癌特别是去势抵抗性及晚期转移性患者中具有很好的应用前景，但目前已进行的研究仍受限于检测技术，并且存在临床研究规模不大及研究质量不足的问题。相信随着科学家的努力和CTC检测技术的进步，CTC将逐步扩展应用于早期局限型、局限进展型以及转移性激素敏感型前列腺癌的诊断治疗过程中，从而为患者带来福音。