间充质干细胞治疗炎症性肠病的应用及前景

李宪哲 谢明颢 练磊

炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）包括溃疡性结肠炎和克罗恩病（Crohn's disease，CD），以反复发作的肠道炎症和黏膜溃疡为特点，其发病与多种因素有关，包括环境因素、遗传因素及自身免疫应答等[1]。当前，IBD已成为一种全球性疾病，其发病率呈逐年上升趋势，尤以亚非国家较为显著[2]。在亚洲，溃疡性结肠炎的年发病率为1.0/10 万～ 2.0/10万，患病率为4.0/10万 ～ 44.3/10万；CD的年发病率为0.5/10万～ 1.0/10万，患病率为3.6/10 万 ～ 7.7/10万[3]。在中国，推测溃疡性结肠炎和CD的患病率分别为1.6/10万和1.4/10万[4]。目前IBD的治疗主要以药物控制肠道活动性炎症和调节免疫紊乱为主[5]。但药物远期治疗效果并不理想，尚无有效药物可以彻底改变IBD患者的肠道炎症状态，部分患者后期仍需外科手术干预[6-7]。为此，寻找一种治疗效果更佳且副作用更少的新疗法成为治疗IBD的当务之急。间充质干细胞（mesenchymal stromal cells，MSCs）因其具有多向分化、免疫调节及组织修复功能，已成为IBD治疗的一种新选择，是目前的研究热点，也是未来的治疗趋势之一。本文综述了MSCs的概况及其在IBD治疗的作用机制及应用前景，希望为进一步深入研究MSCs治疗IBD方面提供参考。

一、MSCs的概况

自1966年Friedenstein等[8]首次从豚鼠骨髓中分离并培养出MSCs后，对其性质及潜在应用的研究从未间断。1991年Caplan等[9]提出这些MSCs可分化为所有间叶细胞，并具有促进间叶组织再生的假设，直到1999年这种假设才被Pittenger等[10]证实。MSCs几乎存在于所有组织中，除可来源于长骨骨髓外，还可来源于脂肪、脐带血、胎盘、羊水、乳汁、神经、皮肤及牙髓等[11-14]。

体外培养的MSCs体积小，核浆比大，在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长，细胞中央有卵圆形核，向外伸出2 ～ 3个长短不同的触角[15]。为了标准化不同来源的MSCs，在2006年，国际细胞治疗协会对MSCs的定义达成了3个最低标准共识[16]：（1）具有贴壁性；（2）表面抗原包括CD73+、CD90+、CD105+、CD11b-、CD14-、CD34-、CD45-、CD19-、CD79a-、HLA-DR-；（3）在体外具有可分化为成骨细胞、成软骨细胞和脂肪细胞的能力。

根据最近的研究发现，MSCs对IBD[17]、心肌梗死[18]、肝硬化[19]和脊髓损伤[20]等均有治疗效果。有研究认为MSCs发挥作用主要是通过分化成某种特定细胞，起到细胞替换作用，从而修复损伤组织[21]。但也有研究认为，MSCs就像一个 “分泌工厂”，通过分泌细胞因子或外泌体，调节肠道免疫微环境并可促进损伤部位的细胞再生和组织修复，这也是MSCs近年来研究的热点之一[22]。

二、MSCs治疗IBD的机制

MSCs可参与免疫调节并具有自我更新、多向分化的能力，因而其治疗IBD的机制并不是单一的，是多种因素、多种机制共同作用的结果。以下将介绍MSCs治疗IBD的可能机制。

（一）免疫调节

MSCs可通过细胞接触、可溶性细胞因子和分泌的外泌体来发挥免疫调节功能，进而具有治疗IBD的作用。

1、通过细胞接触和诱导可溶性细胞因子，MSCs可以改变在IBD发病中具有重要作用的几乎所有免疫细胞的功能。将从IBD患者肠道提取的活化巨噬细胞与MSCs共培养，发现其肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-12的分泌水平明显下降[23]。MSCs可抑制M1型巨噬细胞并促进其向M2型巨噬细胞分化[24]。MSCs还可通过抑制自然杀伤细胞的增殖和毒性，减少B细胞的增殖和活化，抑制T细胞及树突状细胞的成熟，发挥MSCs的免疫调节功能[25]。最新研究证实，Th17/Treg细胞平衡与IBD的发病有关，MSCs可通过抑制STAT3活化进而调节Th17/ Treg细胞平衡，使实验性肠炎得以缓解[26]。此外，许多研究数据表明，干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）单独或联合TNF-α、IL-1α等可诱导MSCs分泌如IL-10、环加氧酶-2、前列腺素E2 和吲哚胺-吡咯2，3-双加氧酶等可溶性因子或酶，参与MSCs介导的免疫抑制[27]。

2、MSCs来源的外泌体（MSCs-derived exosome，MSCs-EXO）可能是MSCs与肠道受损细胞通讯的主要旁分泌机制。MSCs-EXO是由MSCs分泌的含有功能性蛋白质、mRNA及microRNA等活性物质的膜囊泡，直径为30 ～ 100 nm，在MSCs与肠道受损细胞间信息传递过程中发挥重要作用，可参与调节肠道炎症和损伤修复[28-29]。Yang等[30]研究发现，MSCs-EXO治疗可降低核转录因子kappaBp65、TNF-α、诱导型一氧化氮合酶和环氧合酶-2的mRNA和蛋白水平，同时降低促炎因子IL-1β的表达水平和升高抑炎因子IL-10的表达水平，可有效缓解结肠炎小鼠肠道炎症。Zou等[31]研究发现，MSCs外泌体可抑制巨噬细胞趋化因子CX3CL1和TNF-α的表达，同时上调IL-10的表达，降低局部炎症反应，起到免疫调节的作用。

（二）促进肠道修复

MSCs具有自我更新及多向分化的潜能，能促进肠道受损组织的修复。MSCs具有向肠道的损伤及炎症部位趋化的能力，这种能力称之为“归巢”[32]。已有从肠黏膜及黏膜下组织分离得到MSCs的报道[33]。将表达绿色荧光蛋白的骨髓MSCs移植到结肠炎大鼠模型中，28 d后大鼠结肠表达绿色荧光蛋白的上皮细胞达到37.6%，证明了MSCs具有分化为结肠上皮细胞的能力，进而促进肠道修复[34]。MSCs能够特异性地迁移和种植于受损的组织部位，在那里它们可以分化为功能性细胞以替代受损细胞。在实验性大鼠结肠炎模型中，一些MSCs在到达炎症部位后可发育为肌成纤维细胞，上调α平滑肌肌动蛋白和结蛋白的表达[35]。也有研究认为，虽然MSCs能够通过自身分化替代受损细胞，但它们的组织修复特性主要是由于它们能够分泌多种细胞因子，促进肠上皮细胞的再生和血管再生，同时通过分泌蛋白水解酶和血管生成因子抑制组织细胞凋亡和纤维化[36]。以上结果表明，MSCs能够定向迁移、定植于肠道的损伤和炎症部位，分化为肠上皮细胞及分泌多种细胞因子，进而发挥促进肠道修复的作用。

三、MSCs在IBD治疗中的应用

目前，MSCs无论是在IBD的临床前基础研究还是在临床试验中均被广泛应用。大部分的临床前基础研究证实MSCs对IBD动物模型有较好的治疗作用，但仍需开展临床试验进一步评估MSCs在人IBD治疗中的有效性及安全性。以下分别从目前的临床前基础研究和临床试验两方面，介绍MSCs在IBD治疗中的应用情况及治疗效果。

（一）临床前基础研究

大量的临床前基础研究已经在细胞水平和动物模型上开展，以验证MSCs在IBD中的治疗作用。实验所用动物多为葡聚糖硫酸钠和三硝基苯磺酸等诱导的结肠炎大鼠、小鼠或豚鼠模型等。到目前为止，大部分的研究表明MSCs可有效改善IBD动物模型的症状及病理组织学评分。He等[37]将MSCs作用于结肠炎小鼠模型，并测定结肠组织中TNF-α及IL-1等炎症因子的浓度，提出MSCs可能通过免疫调节抑制肠道炎症，缓解小鼠结肠炎。Zuo等[38]将绿色荧光蛋白转载到同种异体的MSCs上，发现MSCs的治疗作用可能与Treg细胞的再分布有一定关系。Qu等[39]通过皮下注射的方式，将带有荧光染色的MSCs输注到IBD大鼠模型上，发现MSCs的治疗作用可能与受损组织的再生修复相关。Banerjee等[40]、Robinson等[41]和Xie等[42]则分别将来源于人脐带血、骨髓及脂肪组织的MSCs应用于动物模型上，也可达到促进症状缓解及病理组织修复的目的。Lian等[43]通过三硝基苯磺酸灌肠诱导CD纤维化小鼠模型，提出MSCs可通过调节炎症环境，抑制TGF-β/Smad信号通路和改善上皮-间质转化发挥抗CD肠道纤维化的作用。但并不是所有的研究都提示MSCs对治疗IBD有效。最近Nam等[44]通过腹腔注射的方式将同种异体骨髓来源的MSCs应用于葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠模型上，发现其在控制结肠炎及改善组织病理学严重性上并未起明显作用，在降低死亡率与疾病活性评分指数上跟对照组比较差异无统计学意义。虽然这样的阴性结果研究数量较少，但同样值得关注。总的来说，MSCs可以通过抗炎、调节免疫及促进肠上皮修复等机制治疗IBD。

尽管大部分的临床前基础研究证实MSCs对IBD有治疗作用，但是动物实验研究的数据并不一定适用于人的临床试验，MSCs在人IBD治疗的安全性及有效性仍需进一步评估。其原因主要有以下2点[45]：（1）人IBD的发病机制未明，是由多种因素导致的免疫相关性疾病，而目前的动物模型通常是由药物诱导所得，并不能完全反映人IBD的所有特征；（2）不同物种来源的MSCs在功能上存在差异，人与鼠科动物MSCs抗炎的作用机制是否相同也尚未达成共识。因此，MSCs对人IBD有无治疗作用尚需临床试验证实。

（二）临床试验

目前有近500项在美国国立卫生研究院（NIH）注册的MSCs临床试验正在进行，其涉及从IBD、多发性硬化到骨和软骨修复等多种疾病[46]。从当前已完成的MSCs治疗CD合并肛瘘的Ⅰ～ Ⅲ期临床试验结果来看，有超过半数患者可以完全缓解，至少有2/3患者对治疗有应答，且尚无与MSCs输注有关的严重不良反应报道[47]。这充分说明MSCs治疗CD合并肛瘘具有有效性和安全性。此外，当前已完成的MSCs治疗IBD的临床试验结果表明，无论是同种异体还是自体MSCs对治疗IBD均有一定的临床应答率和缓解率[47]。García-Olmo等[48]使用自体脂肪来源的MSCs局部注射治疗5例CD合并肛瘘患者，除了1例患者因细胞培养污染退出实验外，其余4例患者共8个瘘管中，有75%的瘘管在治疗8周后愈合，另25%的瘘管虽未完全愈合，但其渗漏也明显减少，且治疗过程中未出现明显副作用。Ciccocioppo等[49]临床试验中，完成实验的10例患者中，7例患者的瘘管达到完全愈合，3例患者的瘘管不完全愈合，CD活动指数（CDAI）和肛周疾病活动指数（PDAI）评分均下降。Panés等[50]进行的临床试验中使用同种异体脂肪来源的MSCs（Cx601），107例复杂CD合并肛瘘患者中有53 例患者的瘘管愈合且愈合所需时间缩短，患者PDAI评分改善。Molendijk等[51]使用同种异体骨髓来源的MSCs治疗21例难治性CD合并肛瘘患者，结果显示局部给予MSCs与患者的严重不良反应无关，局部注射低剂量MSCs疗效优于高剂量MSCs。这些研究均证实了局部注射MSCs对难治性CD合并肛瘘的有效性和安全性。

此外，Zhang等[52]、Liang等[53]和Forbes等[54]使用同种异体来源的MSCs治疗难治性IBD，治疗过程中并未出现排斥反应及与MSCs输注有关的严重副作用，患者肠道炎症明显好转。Dhere等[55]使用自体骨髓来源的MSCs静脉注射治疗12例难治性CD患者，发现所有患者均能很好地耐受MSCs的输注，未见剂量限制性毒性。

如上文所述，临床上用于治疗的MSCs来源包括自体及异体两种。自体来源的MSCs因其来自宿主本人，无免疫排斥。已有研究表明，从CD患者提取的MSCs与健康人群的MSCs表型相似，并具有相同的功能[57]。而MSCs的低免疫原性，使异体MSCs在临床上使用成为可能。有研究报道，采用异体来源的MSCs治疗难治性的CD，其疗效可观，且在16 例参与实验的病例中，仅有1例出现了副作用，但该副作用不能确定是否与MSCs输注有关[56]。现如今很多临床试验所用的MSCs为异体来源，但并没有异体来源MSCs导致严重副作用或者并发症的报道。异体MSCs相较于自体MSCs的优点在于患者不需承受取材的痛苦，且来源广泛，适用于大规模的药物存储及应用。但异体MSCs在遗传学上的性质与宿主不同，与自体MSCs对比，其疗效、安全性及远期作用都需要进一步验证。

给药方式包括全身性给药和局部给药，全身性给药主要是通过静脉输注的方式，而局部给药的方式则包括腹腔内注射、瘘管内注射等。在动物实验模型中，还有通过灌肠方式给药，但在临床试验中尚无。正如上文所述，瘘管内局部注射MSCs已经证实是治疗CD合并肛瘘的有效方式之一。Dietz等[57]进行了一项为期6个月的Ⅰ期临床试验，应用自体MSCs附着于生物可吸收基质并置入瘘管，12例患者中有10例（83%）达到完全的临床愈合并得到影像学证实。静脉注射MSCs具有易行和微创的特点，但注射后的MSCs主要滞留于肺部，到达肠道炎症部位并能真正发挥作用的MSCs很少[58]。经肠系膜上动脉注射MSCs介入治疗，虽然可增加到达肠道炎症部位的MSCs数量，但因其是侵入性操作且有出现并发症的风险，临床上很少使用。综上，究竟哪一种给药方式更有利于缓解临床症状，需根据具体情况而定，且尚需更多实验验证。

目前MSCs治疗IBD的临床试验研究不足主要包括以下5个方面[17]：（1）双盲、随机对照研究数量不足，缺乏与其他治疗方式的对比；（2）各个研究间MSCs的来源不一，既包括自体与异体的差异，还包括取材组织的不同；（3）局部注射治疗CD合并肛瘘的有效率波动范围较大；（4）评估瘘管愈合所用标准不同；（5）副作用的评定标准不明确。因此，需要进一步开展设计更严谨、对照更合理、标准更明确、样本量更大的临床试验研究，提供更多、更有说服力的研究结果。

四、前景与展望

MSCs因其具有多向分化、免疫调节及组织修复功能，已在IBD治疗的临床前基础研究和临床试验中广泛应用。MSCs移植作为一种微创或无创生物治疗，具有低感染、低风险的特点，可促进IBD患者的肠道黏膜愈合，降低CDAI、PDAI和Mayo评分，改善患者临床症状，提高生活质量，具有很大的治疗潜力。MSCs通过全身性或者局部给药的方式，使其进入体内，虽然研究已经证实了可在有炎症的肠黏膜处发现MSCs，但最终到达炎症部位的干细胞数量有限[59]，腹腔注射仅有不到1%的MSCs能到达结肠炎症部位[60]。而正如前文所述，MSCs本身就像是一个“分泌工厂”，其在组织修复和调节免疫等多方面机制上都与细胞因子和分泌的外泌体密切相关。因此，在未来进一步提高MSCs在IBD中的治疗作用，主要集中在以下4个方向：（1）促进MSCs的归巢能力，增加到达肠道损伤及炎症部位的细胞数量。有研究表明，低氧处理可增加MSCs瘦素和细胞表面趋化因子受体CXCR4的表达，显著增加MSCs“归巢”至受损部位的能力[61]；（2）诱导MSCs旁分泌细胞因子或外泌体，促进其肠道组织修复和免疫调节能力；MSCs-EXO可参与血管生成、免疫调节、抗凋亡和抗纤维化等多方面过程[62]；（3）通过细胞因子体外预处理MSCs，提高MSCs的治疗效应和延长效应时间；有研究证实，在体外使用聚肌胞苷酸对Toll样受体3进行短时间预处理，可提高MSCs对葡聚糖硫酸钠诱导小鼠结肠炎的治疗效果[63]；（4）MSCs与免疫细胞或药物联用，提高MSCs的免疫抑制效应。已有研究表明，MSCs与Treg细胞联用可增强MSCs治疗小鼠结肠炎的免疫抑制作用，有效预防小鼠模型结肠炎的发生，这可能为人类IBD的治疗提供一种新的有效治疗方案[64]。此外，MSCs与6-巯基嘌呤和TNF-α抗体药物联用可增强对单核细胞的抑制作用[65]。

综上所述，MSCs可通过免疫调节及促进肠道修复等多种机制对IBD产生治疗作用，其未来有可能成为IBD，特别是难治性或合并肛瘘的IBD治疗的新方向和新选择。但目前的实验数据多来自于临床前基础研究，临床试验结果相对较少，治疗经验尚且不足。为此，需要更多的研究来证实MSCs治疗IBD的安全性及有效性，探索更多方法来提高MSCs的治疗效果。