间充质干细胞外泌体在阿尔兹海默症治疗中的研究进展

金圣榆 葛丽特,2 综述 卢明审校

阿尔兹海默症（Alzheimer's disease，AD）是一种由多种因素引起，病理机制复杂的神经系统退行性病变。患者的临床表现以认知功能障碍持续性恶化为主。最新研究结果表明，以下4个因素是AD的主要发病机制：（1）神经元内的微管相关蛋白— tau蛋白的过度磷酸化，导致微管塌陷并聚集成神经原纤维缠结；（2）淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein，APP） 的C 末 端（C-terminal fragment，CTF）被β-分泌酶和γ-分泌酶水解后生成β淀粉样蛋白（amyloid β-protein，Aβ），沉积成淀粉样斑块[1]；（3） 在慢性炎症环境下，具有清除Aβ作用的小胶质细胞被激活为M1表型，吞噬能力下降，同时在Aβ的刺激下分泌IL-1β等大量促炎因子，进一步损伤神经细胞，造成神经元变性坏死；（4）大量神经元的死亡和神经突触丧失。相关治疗药物只能在AD的早期起到延缓疾病发展进程，改善小部分功能障碍，减轻相关临床症状的作用，却没有办法遏制AD的进一步发展与恶化[2-3]。近几年来，多项研究显示，移植间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）对于AD的几种病理机制都有不同程度的改善与缓解。而最新的研究结果表明，MSCs分泌的一种含有微小核糖核酸（microRNA，miRNA）的囊泡，即外泌体，很可能是相关疗效的机制所在[4]。

一、MSCs外泌体的生物学特性

外泌体是一种在现阶段已知的直径最小的外分泌囊泡，体内所有细胞几乎都能分泌外泌体，包括在脑脊液、黏膜分泌液和血液等多种体液中[5]。外泌体可以作为载体将mRNA和miRNA从来源细胞转载到远端受体细胞内。这是一种新的信号传递方法，主要通过调控受体细胞基因的转录、翻译和表达，影响相关蛋白质的合成和表达，从而发挥不同效应[6]。

MSCs外泌体在临床应用中具有多种方式，例如RNA干扰（RNAi）治疗、药物传输，以及作为疾病的生物学检验标志[7]。MSCs外泌体能够产生类似于来源MSCs的再生与修复潜能，这一功能己经在各种疾病模型中得到证实。MSCs外泌体能有效降低平均肺动脉，抑制肺部炎性细胞浸润，还可以减少心肌梗死的面积，改善再灌注的损伤[8]；同时还能降低炎性因子TNF-α的表达，起到避免组织的炎性反应及抗凋亡作用[9]。

在查阅相关文献后，总结出外泌体能通过促进抗炎、调节免疫功能、加强Aβ降解、促进神经细胞轴突生长等，从以上这些方面，针对AD的几项核心病理机制来发挥其治疗效用，起到延缓疾病进程的作用。另外，MSCs外泌体用于治疗AD具有以下优势：（1）作为无细胞制剂，不会产生免疫排斥反应；（2）不存在伦理矛盾等问题[10]；（3）性质更稳定，易于保存，便于管理及运输；（4）外泌体的直径小，能顺利通过血脑屏障，对中枢神经系统直接产生效用；（5）拥有的各项生物学功能不会因为细胞繁殖传代而失去效用[11-12]。这些特点都使得MSCs外泌体成为一种有着巨大潜力的治疗AD新方法。

二、MSCs外泌体在AD治疗中的应用

（一）MSCs外泌体的免疫调节/抗炎作用

MSCs外泌体能够通过缓解病理异常区域的炎症反应来改善神经功能。有研究表明MSCs外泌体在神经损伤动物模型中具有治疗效果，并能明显改善模型动物的运动协调能力和空间学习能力。Cui等[13]将预先用低氧环境处理的MSCs通过超速离心的方式获取其外泌体，将收集的外泌体从尾静脉注入双转基因AD模型大鼠体内，发现这些外泌体能够使促炎细胞因子TNF-α、IL-1的表达下调，而同时抗炎细胞因子IL-4、IL-10的表达上调，使AD模型大鼠的学习与记忆能力得到明显提高。而Chen等[14]在另一个实验研究中，提取了骨髓MSCs外泌体，纯化后将外泌体加入包括单核细胞在内的血液微环境中，经过检测发现外周血所处环境中促炎细胞因子TNF-α、IL-1的含量明显减少，而生长转化因子以及包括IL-4、IL-10在内的抗炎细胞因子含量显著增加；进一步检验结果表明，与对照组相比，加入MSCs外泌体后血液中的抗炎型辅助T细胞—Th2型大幅度增加。

淋巴细胞有抗炎型与促炎型之分，在与MSCs外泌体共培养后，抗炎型淋巴细胞所占比例明显增加，同时淋巴细胞的增殖速度大幅下降，从而能够发挥免疫调节作用[15]。巨噬细胞与MSCs外泌体共培养后，分泌抗炎性细胞因子的能力大幅度提高，同时向抗炎型细胞（M2型细胞）分化的比例明显上升。Li等[16]将人脐带MSCs外泌体加入了巨噬细胞炎性环境中共培养后，检测到抗炎细胞因子的浓度明显提高，而促炎细胞因子含量较前大幅减少。这一结论也在严重烧伤模型大鼠实验中得到了进一步证实。经过MSCs外泌体处理后，烧伤模型大鼠血清中促炎因子TNF-α和IL- 1β的含量减少，而具有抗炎效果的IL-10浓度升高，才能够减缓烧伤引起的炎症反应[17]。这些研究结果表明，MSCs外泌体能在体内环境中产生明显抗炎作用，减轻由于Aβ沉积产生的炎症反应，避免神经细胞变性坏死，达到减缓病程进展的效果。

（二）MSCs外泌体促进Aβ降解

MSCs外泌体对于治疗AD有效果的另一种原因是能通过几种不同方式减少体内沉积的Aβ。Yuyama等[18]发现减少中性鞘磷脂酶-2（neutral sphingomyelin-2，nSMase2）的含量可以降低AD患者病理性细胞的分泌功能，通过拮抗nSMase2的合成，使得病理性外泌体减少，最终达到降低脑中Aβ含量的目的。他们的另一个实验结果表明，减少nSMase2能同时抑制鞘磷脂向神经酰胺转化，侧面升高鞘磷脂含量，进而促进正常神经元的外泌体分泌，这些外泌体能促进淀粉样蛋白沉积斑块也就是Aβ沉积物发生构象变化，转变为对脑组织没有毒副反应的纤维组织[19]。周围的小胶质细胞将这些纤维组织摄取后，胞内的溶酶体就进行分化降解，最终使Aβ的含量减少。而MSCs外泌体的存在能促进整个降解过程的加速运转[18]。

Yuyama等[20]在实验中，将SMS2的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）序列转入正常神经元后，检测到神经元外泌体分泌增加，Aβ清除量增加，达到了延缓AD病程进展的效果。同时外泌体表面富含鞘糖脂，能促进Aβ与外泌体相互结合，拥有这一特性使得外泌体能够成为Aβ有效的吸附载体，加速移除体内的Aβ。有研究发现，在正常人体内，脑组织中最能有助于分解吸收Aβ的其中之一是被命名为脑啡肽的酶[21]。实验表明，向高表达Aβ相关蛋白的AD模型细胞所处环境中加入脂肪MSCs外泌体后，细胞内与周边环境中能检测到的Aβ含量明显下降，而脂肪MSCs外泌体的特点之一是富含有超过平均水平的脑啡肽酶[22]。这一结果表明脂肪MSCs外泌体在分解Aβ方面能发挥重要作用，而Aβ沉积正是AD病理改变的核心机制之一，体现了MSCs外泌体治疗AD的潜能。

（三）MSCs外泌体保护神经元和突触/促进神经元轴突生长

Mariana等[23]实验结果显示，MSCs及其外泌体能够保护海马区神经元和相关突触，避免受到Aβ沉积所产生的氧化应激反应导致的损伤。Cui等[13]通过总结实验结果，推测MSCs外泌体可能通过改善损伤突触的功能以及损伤部位的免疫调控达到改善APP/PS1双转基因AD模型小鼠的学习和记忆能力。另一实验表明，MSCs外泌体同神经细胞进行质膜融合后，能将携带的miR-133b转入神经元，促进神经细胞轴突修复生长，减轻造模产生的神经损伤。同时MSCs外泌体内富含miR-17-92，外源性增加含量，可促进少突胶质细胞生成和轴突生长。在短暂性脑缺血小鼠模型中，静脉注射高表达miR-17-92的外泌体后，与注射普通MSCs外泌体相比，能增强神经元的可塑性、轴突生长的速度，达到促进神经功能恢复的效果[24]。

Chen等[25]研究结果显示，脂肪MSCs外泌体内含有丰富的神经因子能促进功能受损的脑组织修复再生。包括神经胶质衍生神经营养因子、神经生长因子等，能刺激受损神经元轴突生成。脂肪MSCs外泌体的这一效应在急性缺血性卒中大鼠模型中得到了有效的应用，使大鼠脑组织内急性缺血诱发的梗死面积减少，同时在大鼠功能评估的各项测试中，脑缺血症状得到明显的改善。

（四）MSCs外泌体可作为RNA运载体治疗AD

miRNA是一种非编码短链RNA，在一些生理现象中负责调控表观遗传性状[26-35]。miRNAs调控多种生物过程，如生长、发育、血管生成、干细胞更新和分化[35-39]。MSCs外泌体作为一种最新的RNA理想载体，能自由通过包括血脑屏障在内的各种生物屏障，同时保证外泌体内含有的小分子生物活性物质不会被网状内皮组织系统细胞分解与清除，达到进行跨器官甚至跨系统靶向分泌的目的[40]。大量的实验数据显示，AD患者大脑中，miR-9、miR-26b、miR- 181、miR- 221等几个miRNA的含量有不同程度的增加或减少[41]。特定miRNA的差异表达有可能促进AD病程的发生与进展。

RNAi能够下调某些靶向基因的表达。研究表明，RNAi可以将miRNA模拟物（miRNA mimics）和miRNA拮抗剂（antimiRNA）两种类型的miRNA作为靶向目标[42]。借助MSCs外泌体进入机体内的mimics能够模拟miRNA前体，下调与AD疾病相关的蛋白表达。利用mimics来降低AD发病机制中特异性蛋白的表达从而延缓AD病程进展，可以作为AD治疗的有力策略[43]。而另一种可用于治疗包括AD在内各种疾病的方法，就是antimiRNA能够抑制miRNA的表达[44]。对于某些特定miRNA可以通过注射互补RNA序列来阻止翻译。只要能识别AD患者的miRNA缺陷，就可以利用antimiRNA提供新的治疗方式。

三、总结与展望

研究至今，多种体内、外实验结果表明，MSCs外泌体能分别在AD的几个核心病理机制环节产生较好疗效。能促进脑内沉积的Aβ降解，保护神经细胞及突触不受炎症反应导致的损伤，并同时促进已损伤部位的神经元轴突生长，改善AD模型大鼠的行为、认知功能。充分体现了在AD治疗中拥有的疗效及潜力。然而，目前关于MSCs外泌体的临床应用仍存在一定的局限性：（1）目前应用于提取外泌体的方法耗时较长、效率较低，寻找高效提取外泌体并有效应用于临床的方法亟待探索研究；（2）MSCs外泌体调节免疫反应、促进Aβ降解和促进轴突生长的具体机制探讨还不明确，需要后续实验进一步研究；（3）将携带miRNA和siRNA的MSCs外泌体作为载体，应用于动物体内的安全性以及具体实施方案还未有体内外实验验证，需要进一步研究讨论。