自噬细胞在肾脏移植中的研究进展

雷迪 郑楠薪 隋明星

实验证据表明，在可能导致细胞死亡的环境中，自噬在细胞适应环境的过程中起主要作用[1-2]。由于经过了缺血-再灌注、小动脉血管收缩、毛细血管破坏以及间质纤维化等过程，移植肾初期通常处于缺氧状态[3]。此外，移植肾脏的炎症环境促进释放危害分子，进而激活体液免疫和细胞免疫。由于自噬主要的激活因素是缺氧和炎症介质，而这二者是肾移植最主要的应激因素[4]，所以自噬一定参与调节移植肾的稳态平衡，且自噬的参与程度远远高于人类认知，目前并没有大量的实验室或临床证据[5]。

一、自噬生物学

细胞自噬开始于隔离膜的形成和扩张，然后通过一系列的步骤，包括隔离膜闭合形成自噬体，与溶酶体接触、融合形成自噬溶酶体，通过溶酶体的酸性水解酶分解、降解包裹的物质及其内膜，回收形成的产物。自噬可以识别和降解特定的底物，如P62 （sequestosome 1，一种泛素样结合蛋白），多泛素化蛋白聚合物，细胞器，代谢产物或外界侵袭的微生物[6]。

自噬体的形成是自噬过程中具有标志性的关键步骤。自噬体膜起源于何处仍然存在争议，可能的来源包括高尔基复合体、内涵体、内质网、线粒体和质膜。在哺乳动物中，细胞自噬的核心机制至少涉及五组蛋白质或蛋白质复合物：（1）UNC-51-样激酶（ULK）1/2复合物是必不可少的诱导蛋白；（2）磷脂酰肌醇3激酶（PtdIns3K）复合物参与囊泡成核；（3）自噬相关基因跨膜蛋白（ATG9L1）可能促进其他来源的膜形成自噬体；（4）微管相关蛋白轻链3-磷酰胺乙醇胺（LC3-PE）和ATG12-ATG5-ATG16L复合物，这2个共轭系统参与了囊泡的伸长和形成；（5）可能参与介导自噬后期步骤（囊泡融合和内容物降解）的蛋白质[7-8]。在自噬调节机制的上游，有一个复杂的信号网络调控。mTOR信号通路，特别是雷帕霉素靶蛋白复合物1（mTORC1），是自噬的主要调节途径。许多可以通过营养、生长因子和能量等信号激活的信号转导通路，都可以整合并入mTORC1通路参与调节细胞自噬[8]。同时一些不依赖mTOR通路的机制也被提出过。需注意自噬通常由多种细胞应激所诱发，如内质网应激、缺氧应激、氧化应激、DNA损伤和病原体的侵入。

大多数情况下细胞自噬是为了维持细胞稳态，而应激诱导的自噬则是为了维持生存而采用的适应性和保护性策略。在代谢应激刺激下，细胞自噬产生氨基酸和脂类以供蛋白和腺苷三磷酸 （adenosine triphosphate，ATP）的合成。自噬可以清除蛋白聚合物、受损的细胞器和细胞内的病原体。自噬也减少了DNA损伤和染色体不稳定性。尽管自噬对细胞具有保护作用，但自噬也可能导致细胞死亡。然而，自噬并不是在生理或病理条件下直接杀死细胞[9]，虽然过度自噬会导致细胞器大量降解，从而造成损害[10]。

自噬与细胞死亡、生存的关系非常复杂[11]。自噬与凋亡并不是对立的，反而共用很多相同的调节因子。因此自噬与凋亡可以拮抗、合作甚至互相促进，从而调节细胞的生存。自噬是否促进细胞死亡仍存在争议（自噬性细胞死亡）。因为“自噬性细胞死亡”的定义尚未明确，现在认为该定义需满足以下条件：（1）当细胞死亡时，caspase（半胱天冬氨酸蛋白酶）未被激活；（2）在死亡细胞中自噬过程增加，而不仅是自噬标记物升高；（3）抑制自噬能够防止细胞死亡。在哺乳动物中[12]，使用多种自噬相关基因（ATGs）被敲除或更改的小鼠模型，都没有明确的证据表明在生理条件下存在自噬性细胞死亡。大多数实验显示，哺乳动物细胞的自噬性细胞死亡需要在体外培养的条件下，并且伴有细胞凋亡缺陷如Bax-/-Bak-/-双基因敲除[13]。这提示在未经基因修饰的哺乳动物细胞中，生理条件下的死亡是伴有自噬而非由自噬引起。

自噬参与动物发育和细胞分化[14]。值得注意的是，细胞自噬参与了大量疾病的病理生理过程，包括神经退行性疾病，癌症，老化，传染病和炎症性疾病，心血管疾病，代谢性疾病，肺部疾病和肾脏疾病[15-16]。

二、受损肾脏中自噬的作用

（一）缺血再灌注损伤

缺血再灌注损伤中存在由冷保存诱导激活的自噬。氧化应激可以上调自噬调控因子的表达，包括LC3和Beclin1，并促进LC3依赖ATG-4的磷脂化，使自噬体成熟。利用3-甲基腺嘌呤抑制自噬可以增加小鼠的缺血再灌注损伤，说明自噬可能具有保护作用[17]。肾小管细胞近端和远端的Atg5缺陷可以导致肾功能受损，并使肾脏更易受到缺血损害，使得线粒体受损累积以及肾小管细胞凋亡和增殖[18-19]。这些结果在敲除了肾小管ATG7基因的小鼠中得到了证实，该小鼠比野生型小鼠对肾缺血再灌注损伤更敏感[20]。总的来说，自噬在缺血再灌注损伤中可以维持肾小管上皮细胞的完整性。

（二）缺血应激下的非常规蛋白分泌

现有的证据表明，自噬参与细胞间通讯网络的建立，特别是在细胞凋亡过程中，自噬调节细胞死亡的微环境和结果。在应激条件下（如饥饿）常规的分泌受到抑制（分泌蛋白质的经典途径需要N-末端的信号肽，它允许多肽在内质网内经过翻译后进行逆向易位、折叠和质量控制、运输到高尔基体，从而以囊泡形式转运到细胞膜、融合并分泌），而非常规分泌途径可能被激活，并成为细胞间通讯的主要模式。目前并不清楚这些非常规分泌的蛋白和免疫分子是如何释放到细胞外的。参与自噬的成分，包括LC3，ATG16L1和溶酶体相关膜蛋白，也可能来自营养缺乏的、自噬体积聚的内皮细胞[21]。这个过程依赖于caspase激活，表明细胞凋亡可以促进自噬。人血管内皮细胞饥饿条件下释放的囊泡已被确定与凋亡和自噬有关[22]。这些囊泡不同于经典的凋亡小体，因为它们不含有细胞核成分，并且不依赖Rho关联含卷曲螺旋蛋白激酶（Rock）1的活化。它们反而含有不同成熟阶段的自噬体以及线粒体。这些囊泡也富含危险分子信号、ATP，可能在缺血条件刺激下参与先天免疫的调节。

（三）自噬作为缺血再灌注损伤的治疗靶点

设计具有调节自噬功能的药物、并在临床上用于预防缺血再灌注损伤的最大挑战是生物靶向药物的特异性。迄今为止最好的成功药物是西罗莫司，通过抑制mTORC1来诱导细胞自噬，但是实验室和临床证据表明它会阻碍肾脏功能恢复[23-24]。事实上，移植肾功能延迟恢复与急性肾小管坏死有关，决定于受损的肾小管上皮细胞进入细胞周期和增殖的能力，而mTOR抑制剂可以抑制细胞的生长，因此降低了细胞的增殖能力[23,25]。其他调节自噬药物也存在同样的问题，如巴弗洛霉素，氯喹或3-甲基腺嘌呤，它们具有广泛的生物学效应，不仅调控自噬，而且也可以加重组织损伤。比如3-甲基腺嘌呤通过抑制I类PI3K信号通路诱导细胞死亡，又能通过抑制Ⅲ类PI3K诱导自噬，进而抑制细胞死亡。故而需要更精确的途径来微调自噬。比如多肽类的Tat-beclin1，是自噬蛋白Beclin1的一部分，可以与HIV-1的Nef结合，可以强效诱导自噬[2]。Tat是种来源于HIV的、辅助病毒进入细胞的蛋白质。当与Beclin1融合后，Tat可以使Beclin1不需要经过转染即可进入细胞。这种多肽能特异性激活自噬，从而清除蛋白质聚合物和病毒，但没有其他自噬方面的副作用。

三、自噬与免疫抑制药物

（一）环孢素A的肾毒性

环孢素可以诱导肾小管上皮细胞的内质网应激[26]。受内质网应激影响的细胞会激活未折叠的蛋白质，以减少蛋白负荷并增加初期蛋白折叠，促进细胞保护[27]。最近的证据表明，内质网应激可以启动自噬，具体机制可能包括蛋白激酶RNA样内质网激酶和真核起动因子2α，从而调节自噬的表达、隔离膜的形成和IRE1激活（JNK和XBP1可能调节细胞自噬）。特别是在内质网应激条件下，自噬已被证明能够减轻内质网应激和减少细胞死亡[28]。环孢素诱导的内质网应激可以调节自噬。在体外培养的人上皮细胞中，内质网应激通过激活自噬以抵抗环孢素的伤害。如果特异性敲除Beclin1来抑制自噬，那么环孢素诱导的肾小管细胞的细胞毒性会增强，这表明了自噬可以减轻环孢素的毒性[29]。大鼠环孢素肾毒性模型同样证实，环孢素增加了肾脏中LC3-Ⅱ和Beclin1的表达，且与剂量相关。相较于环孢素组，使用环孢素联合普伐他汀或N-乙酰半胱氨酸降低了尿中8-羟基-2'-脱氧鸟苷浓度，继而降低了LC3-Ⅱ表达和p62阳性的细胞数，表明环孢素A诱导的氧化应激可以激活细胞自噬[30]。

（二）西罗莫司的副作用

西罗莫司用于预防急性排斥反应。西罗莫司通过抑制mTOR信号通路以诱导细胞自噬。西罗莫司不抑制钙调神经磷酸酶，因此，它缺乏钙调磷酸酶抑制剂类的肾毒性资料。在临床实践中，西罗莫司最初是作为钙调磷酸酶抑制剂的辅助用药，而现在常用于低肾毒性的药物方案中。但西罗莫司有一系列的不良事件，包括蛋白尿、系统性炎症、水肿、皮肤疹、口疮、肺炎、血脂异常和糖尿病[31]。虽然大部分西罗莫司导致的副作用被认为与抑制mTOR相关，但确切的机制尚不清楚，自噬对其他mTOR相关的生物效应（如翻译的起始和延伸）的影响也不明确。没有明确的证据证实自噬导致了这些副作用，但是鉴于mTOR和自噬在足细胞的抵抗应激[32-33]和在调节免疫反应[34-35]中的重要地位，可以猜测，通过抑制mTOR通路介导的自噬与这些副作用有关。但目前证据并不多。在西罗莫司引起的副作用中，西罗莫司诱导的β细胞损伤可能涉及细胞自噬[36]。这项研究利用了胰岛移植小鼠模型，在西罗莫司治疗后出现明显增强的细胞自噬，导致了胰岛β细胞受损，使得胰岛移植手术后移植物失功。这些结果还表明，3-甲基腺嘌呤改善了体外和体内的西罗莫司相关的β细胞失功。虽然这只是初步的、未涉及肾脏移植的研究，仍然可以推测自噬可能直接参与西罗莫司的副作用。

四、自噬和免疫调节

自噬调节先天免疫和获得性免疫，并具有明显相反的调节结果。自噬可以减轻炎症，自噬能降解蛋白聚合物和变性的线粒体，而这两者可以加剧氧化应激、激活炎症[5,37]，同时自噬可以调节细胞因子的非常规分泌；但它又促进T细胞的克隆增殖（为这一过程提供营养），促进胸腺孵育，提供MHC Ⅰ类和Ⅱ类抗原呈递（以及交叉呈递）的多肽[38-39]。总的来说，自噬促进细胞内病原体清除。此外，许多触发免疫反应的物质可以激活细胞自噬，如Toll样或nod样受体配体或者炎性细胞因子[37,40]。

自噬在调控先天性或获得性免疫功能方面的复杂机制尚未被研究透彻，而这些机制与移植和自身免疫病相关。最近，自噬在肾移植中的免疫调节作用出现争议[19,41]。比如，ATG5缺陷的小鼠肾脏肾小管，受到缺血再灌注损伤时，与同窝小鼠相比其巨噬细胞浸润相对较少[19]。这表明，自噬可能抑制无菌性炎症反应，但不知道这是不是死亡细胞（可以释放能激活危险受体的细胞内容物）减少所致，或者是不是自噬对炎症的特异性表现。后者这一假说可以由以下观察到的结果证实：ATG-5缺陷的肾小管中大量累积变性的线粒体，形成强大的促炎剂[19]。除了缺血性应激，细胞因子的刺激也可以激活肾脏细胞的自噬。干扰素γ是移植肾稳态平衡的主要调控因子。干扰素γ在炎症过程中有重要的作用，使得它也与移植特别相关，影响移植物的存活[42]。自噬和干扰素γ相互作用。干扰素γ通过Beclin1机制在小鼠的免疫和非免疫细胞中促进自噬，而干扰素γ介导的抗菌效果需要自噬参与[43-44]。人肾小管上皮细胞中干扰素γ激活了自噬。干扰素γ诱导色氨酸代谢，从而激活组蛋白乙酰化酶合成通用控制蛋白2激酶，导致自噬激活剂eIF2a的磷酸化[41]。自噬在干扰素γ作用下会减少分泌炎性细胞因子，这与以前的发现相一致，即自噬减少了IL-1β的产生，继而影响了炎症小体和变性的线粒体的破坏作用[45]。

五、自噬与肾脏移植缺血/再灌注损伤（ischemiareperfusion injury，I/R）

肾脏I/R常常发生于肾移植手术及严重创伤以后，是肾移植手术过程中一种常见的临床病理、生理现象，并成为影响肾移植术后患者康复及生存率的重要因素[46]。现已证实，全身组织器官很多都存在I/R现象，而在肾脏移植I/R过程中，肾小管细胞自噬存在的调控机制有哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路、氧化应激、内质网应激、缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）及其转录目标促凋亡线粒体蛋白（BNIP3）、肿瘤抑制基因P53、Unc-51样自噬激活激酶1 （ULK1）、B淋巴细胞瘤-2基因（Bcl-2）家族蛋白。自噬中的 3 种关键的蛋白复合体，即 mTORC1、ULK1 及 Beclin-1/PI3KⅢ型蛋白复合体调节此过程。自噬启动后，由两类不同的泛素样蛋白系统执行着自噬体的延长，包括ATG5-ATG12通路和泛素样微管相关蛋白1 轻链3 （LC3，ATG8）结合系统。肾脏中的足细胞及近端小管特异性缺失 Atg5或Atg7的小鼠表现出累积错误折叠的蛋白质和变形的细胞器，说明肾脏中的足细胞及近端小管易被I/R。肾脏I/R 的大鼠实验模型中显示受损的肾小管中Beclin-1和LC3的表达升高，缺血的情况下，如果Bcl-2过度表达，自噬将会下降，肾脏受损情况好转；并有研究对GPF-LC3的转基因小鼠进行I/R处理，自噬发生的同时，肾小管也随之出现了形态学的破坏；而对于Bcl-2/GFP-LC3的双转基因小鼠，自噬的发生及肾小管形态学破坏程度均减少[47]。

现已被证实可作为自噬标记物有两种，Beclin-1是促进自噬发生的始动因子，LC3-Ⅱ是位于自噬体上的唯一蛋白[48]。研究发现，丙酮酸乙酯可以抑制I/R，其过程是通过抑制Beclin-1和LC3的表达，减弱自噬的强度，以达到抑制I/ R 的作用[49]。并有研究表示，可溶性晚期糖基化终末产物受体（sRAGE）作为内源性保护物质，可抑制I/R引起自噬。亦有研究显示，静脉注射饱和氢气生理盐水可通过抑制自噬减少I/R[50]。

缺血预处理的过程中，许多内源性机制介导保护着肾脏，以免肾脏遭到 I/R，而其机制有抑制细胞凋亡、储存 ATP、产生促存活细胞因子及抗炎因子。在这期间可诱导自噬发生，通过促进细胞内 ATP 形成，以减轻炎症反应来获取细胞生存。

六、展望

在移植免疫相关的细胞自噬资料非常少，但它可以帮助理解免疫相关过程是如何调节的。有很多值得研究的途径，可以将自噬整合于危险模型，这一模型可以将无菌性炎症（如I/R）与获得性免疫联系起来。再如，线粒体产生的ATP是一种危险信号，可以激活树突状细胞表面的嘌呤受体，且已证实早期凋亡细胞在膜通透性改变之前，需要自噬参与才能释放ATP[51]。其他还有自噬小体中大分子物质如何被处理、消化，抗原呈递细胞如何修饰免疫多肽，以及修饰后多肽的作用[52]。除了炎症，自噬在调节组织稳态的其它生物学功能也刚刚开始研究，比如纤维化，这是移植肾发生组织学改变最重要的特征[53]。

如何在临床实践中监测（诊断和治疗）自噬仍有待解决。到目前为止，在人体组织中利用免疫组化方法检测细胞自噬能力的结果仍不一致，而且可行性也较差[54]。由于自噬是一个动态变化的过程，所以必须通过“通量（f l ux）”来计算，并且需要药物来抑制自噬小体降解，而这种通量几乎不可能在活检标本中检测，因为标本是静态的。细胞中出现大量的自噬体不代表自噬体的生物合成被激活，因为溶酶体的降解作用可以被抑制，也会产生大量自噬体。研究自噬机制的最大挑战是它不是通过转录来调控，也没有直接可用的标记物。潜在可用的标记物，如P62，可以在自噬过程中定量调节，但其表达缺乏特异性，除了自噬还有氧化应激等也可以调节其表达。