Ⅱ型肺泡上皮细胞与特发性肺纤维化的关系研究进展

杨育坤 李晔 朱向情 雷银 王严影 田川 阮光萍 潘兴华

Ⅱ型肺泡上皮细胞（typeⅡalveolar epithelial cells，ATⅡ）是由内胚层衍生的多功能极化上皮细胞，存在于成年哺乳动物的肺部远端，与Ⅰ型肺泡上皮细胞偶联镶嵌排列，形成肺泡囊，参与呼吸膜的形成。ATⅡ虽仅占肺泡表面积的7%，但却占实质细胞总数的16%，可通过分泌大量的表面活性物质，从而减低肺泡表面张力。另外，其还可参与肺部的炎症反应、免疫反应、细胞外基质（extracellular matrix，ECM）调节和损伤修复等多种生物学活动[1]。当前，越来越多证据表明，Ⅱ型肺泡上皮的功能、形态以及数量的正常稳定，可能在维持肺的结构和功能，保持呼吸系统健康方面极为重要。当ATⅡ的功能、形态和数量失调时，便可能导致一连串相关的病理变化[2]。特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一种严重影响肺通气与换气功能的下呼吸道慢性疾病，其发病机理目前尚不明确，可能与遗传、年龄和环境相关，表现为异常的间质炎症和纤维化，以及肺泡结构的破坏。从病理学的角度来看，IPF是以广泛的成纤维细胞、肌成纤维细胞、肺泡和间质巨噬细胞的积累，以及过度的ECM沉积为特征。这些改变最终致使肺瘢痕形成，进而导致慢性呼吸衰竭[3]。近年来，IPF被认为是一种因肺泡上皮受到持续反复损伤而引起的异常促纤维化修复的改变，上皮功能和形态的变化可能在很多方面影响肺纤维化的进程[4]。明确肺泡上皮在纤维化进程中如何发挥作用的机制，可能为临床治疗寻找新的靶点。因此，本文就ATⅡ在IPF中的作用做以下综述。

一、生理条件下的ATⅡ

（一）分泌表面活性物质

ATⅡ位于肺泡表面，顶端突起于肺泡腔中的肺泡上皮细胞，其体积较小，细胞核成圆形，胞质着色较浅，呈泡沫状。在电镜视野下，可见其胞质内较发达的粗面内质网和高尔基复合体，以及丰富的线粒体和溶酶体[5]。同时，在其细胞核上方有较多平行排列成板层状结构的高电子密度大小不等分泌颗粒，称为嗜锇板层小体。这些小体内含有丰富的表面活性物质（磷脂、蛋白质和糖胺聚糖等），这些表面活性物质通过胞吐的方式释放于肺泡腔，并在铺展与肺泡表面形成一层薄膜，具有降低肺泡表面张力，维持肺泡大小及结构的重要作用[6]。

（二）免疫功能

ATⅡ除了分泌表面活性物质，维持肺泡正常结构的作用外，还有重要免疫作用。众所周知，肺作为一个与外界连通的呼吸器官，受到外界微生物、以及有害物质的侵袭是不可避免，这些微生物和有毒物质一方面作为外来有害物质，可被肺部清除。另一方面，其可导致肺部的损伤，引起炎症反应，以及免疫平衡的失调。研究发现，这些变化可能与ATⅡ分泌的表面活性物质的变化有关系。首先在未受到感染或感染轻微的情况下，Ⅱ型细胞通过将多种抗炎和抗微生物物质分泌到肺泡液中而建立外周防御。这些物质包括表面活性物质中的聚集蛋白SP-A和SP-D，抗菌蛋白（如溶菌酶，β防御素2，导管素和脂质运载蛋白2）以及抗氧化剂（如还原型谷胱甘肽）等。同时，肺泡上皮细胞还具有高水平的聚合免疫球蛋白转运蛋白表达，可转运免疫球蛋白于肺泡液中，以及产生补体系统组分的能力。因此，在正常肺的肺泡液中存在多种抗微生物防御，以处理在日常活动中可能遇到的病原体。当这些病原体和有害物质过度聚集于肺部导致持续感染和细胞受损时，ATⅡ可作为一类辅助细胞，在炎症以及免疫平衡中发挥重要作用。有证据表明，在感染时，ATⅡ分泌的SP-A和SP-D增多，这些蛋白质负责识别和调理微生物，将它们呈递给免疫细胞，如肺泡巨噬细胞，以增强微生物清除[7-8]，与此同时，SP-A和SP-D含量的改变可能还会引起巨噬细胞表型变化[9]。另有研究发现，ATⅡ还可以通过分泌细胞因子来调节免疫，如在巨噬细胞的作用下，ATⅡ可分泌RANTES、MCP-1以及GM-CSF，进一步促进巨噬细胞的聚集，刺激巨噬细胞的生长[10-11]。同时，ATⅡ也可与白细胞互相作用。研究发现，ATⅡ可影响白细胞介素的合成，也可参与诱导嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞的分化并维持炎症反应[12]。

（三）增殖修复功能

在正常的肺中，ATⅡ具有增殖分化为Ⅰ型肺泡上皮细胞的能力。生理状态下，肺中肺泡上皮细胞的转换更新是非常缓慢的。当肺损伤后，ATⅡ扩散，去分化，增殖并最终分化成增生型ATⅡ。在这之后，这些细胞中的一些将经历细胞凋亡，其他剩余的细胞则转分化为Ⅰ型肺泡上皮细胞，以维持肺泡正常的结构和功能[5]。

（四）其他影响

在前文中，已经描述了ATⅡ具有丰富的线粒体结构，有研究显示，ATⅡ可跨膜转运钠离子，与肺泡液中水的转运密切相关。这种丰富的线粒体结构，能为转运提供足够的能量，以维持肺泡液中水钠的平衡[7]。同时，ATⅡ在特定的情况下，还可与周围的细胞相互作用。如ATⅡ可通过直接或间接的作用与成纤维细胞之间发生联系，从而调节肺部的损伤修复[13]。另外，ATⅡ也可能与血管内皮细胞、Ⅰ型肺泡上皮细胞之间发生关系[12]。

二、ATⅡ与IPF

IPF表现为广泛的纤维细胞增殖及大量ECM聚集并伴炎症损伤、组织结构破坏为特征的肺疾病。近年来越来越多的证据表明，这种广泛的纤维细胞聚集增殖，大量ECM产生等表现，可能与ATⅡ密切相关[4]。早在1979年，科学家们就发现，ATⅡ结构与功能的完整性可能对是否发生纤维化有重大影响。Haschek等[14]将丁基羟基甲苯通过腹腔注射入小鼠体内，引起小鼠Ⅰ型肺泡上皮的急性损伤，通过观察上皮的超微结构，确定了ATⅡ在此过程中保留完整的生理结构。但之后，研究者对小鼠进行了持续的丁基羟基甲苯吸入处理后发现，由于ATⅡ的破坏，缺失了增殖分化成Ⅰ型上皮的来源，其肺内的胶原蛋白沉积与腹腔注射组相比明显增多。这意味着正常功能的ATⅡ可能作为一类在肺损伤中起修复作用的细胞，抑制其向异常纤维化方向发展，而当ATⅡ衰老凋亡不足时，便会发生改变。

在IPF的发病机制中，ATⅡ的凋亡是其组织病理学中的突出表现。当肺泡上皮受到持续反复损伤的同时，ATⅡ的功能形态一样不断发生着变化，其衰老、凋亡导致基底层的剥脱可能反映该疾病发展中的初始破坏事件，尽管所涉及的分子机制尚未完全了解[15-16]。

当前，一些研究表明，ATⅡ的衰老和凋亡事件的发生，可能与各种因素引起的内质网应激和自噬有关系。内质网（endoplasmic reticulum，ER）是负责维持蛋白质稳态的专门细胞器，其主要用于蛋白质折叠和在蛋白质到达细胞内或细胞外目的地之前对其进行质量控制，任何扰乱蛋白质加工的因素都可能导致错误折叠的蛋白质在内质网中的累积，这一错误蛋白累积于内质网中的现象被成为内质网应激。同时，为响应内质网应激，细胞启动信号级联——未折叠蛋白反应。最初，这一反应可恢复蛋白质稳态，但由于长期或严重内质网应激，最终会导致细胞衰老死亡[17]。关于IPF中的内质网应激，最开始被发现在于表面活性蛋白C基因突变的家族性IPF患者的ATⅡ中，基因的突变导致大量折叠错误蛋白的累积，引发持续而严重的内质网应激[18-19]。随后，许多研究均表明，内质网应激引起的ATⅡ凋亡，在IPF患者中是一个普遍的现象[20-21]。

在ATⅡ细胞中，突变基因（外显子4的缺失或L188Q SFTPC的过表达）会导致内质网应激和细胞凋亡增加[22-23]。William等[24]通过使用Tet-On系统开发了仅在ATⅡ中表达L188Q SFTPC的转基因小鼠。在该突变基因（L188Q SFTPC）的表达下，小鼠肺部ATⅡ获得了持久的内质网应激，但在未使用第二种促纤维化的物质情况下，未表现出异常的纤维化和内皮细胞的凋亡。接着，他们使用博来霉素诱导小鼠肺纤维化模型，与对照组相比，表达L188Q SFTPC的小鼠出现更多的肺纤维化并伴随着静态肺顺应性的降低，同时还包括肺泡上皮细胞凋亡的增加和肺中更多的成纤维细胞聚集。这些数据表明，ATⅡ的内质网应激，至少在这些模型中可达到的水平，还不足以诱发肺纤维化。但这种内质网应激水平，可能促进肺纤维化的进程以及ATⅡ的衰老与凋亡。

另外，自噬是一个吞噬自身细胞质蛋白或细胞器的过程。其是由各种生理应激激活的细胞过程，当细胞质组分发生功能失调时，双壁膜囊泡便可将其包裹隔离，形成自噬体，并递送至溶酶体以进行破坏和再循环，其作为一个清除功能失调组分的过程，在细胞的衰老与凋亡中都发挥重要作用[25]。目前研究发现，ATⅡ自噬功能的改变可能也在肺纤维化中扮演重要的角色[26]。如前所述，IPF患者肺组织中ATⅡ表现出过度的内质网应激[18-19]，这种现象正是促进细胞自噬发生的关键因子[27]，但此时，在纤维化中ATⅡ细胞的自噬能力却与正常相比相对不足。Bueno等[28]观察到，在IPF患者中ATⅡ表现出明显的畸形和功能障碍的线粒体积聚。而这种IPF中线粒体受损和肺衰老的改变，与线粒体自噬密切相关的PINK1低表达有关。另外，关于肺纤维化，自噬的增加也可能不是完全有利的，在某些情况下可能也促进细胞的衰老和凋亡。研究发现，在胺碘酮激发导致的肺损伤中，Ⅱ型上皮细胞发生进行性的肥大和板层小体聚集，聚集的板层小体不断被膜包裹，形成自噬体。然而，在这种情况下，板层小体的积累与更多自噬体的形成并没有减少纤维化的作用，反而促进了肺间质纤维化的发展和上皮细胞的凋亡[29-30]。

最后，IPF中肺泡ATⅡ的凋亡还可能是基因组不稳定性，DNA损伤和异常DNA修复的结果。ATⅡ端粒反转录酶（TERT）、端粒酶RNA组分（TERC）以及其他端粒相关基因的改变均参与其中[31-32]。

总的来说，ATⅡ在各种有害因素的影响下，会发生一系列的变化。而这些变化最终会导致ATⅡ的功能失调和凋亡，从而影响IPF的发生和发展。

三、ATⅡ、成纤维细胞和免疫细胞在IPF中的影响和联系

如前所述，在有害因素损伤和（或）基因突变的情况下，肺泡上皮不断损伤，导致上皮基底层剥离，ATⅡ开始增殖以填充间隙并重新覆盖裸露的基底层。如果其大量衰老凋亡不足以填补空缺时，间质成纤维细胞便被激活并开始产生过量的ECM成分[14]。尽管，当前研究表明从肺泡上皮损伤到成纤维细胞的聚集和激活再到过量的ECM产生是一个极其复杂的过程，尚且不完全清楚。但是，ATⅡ在纤维化的过程中发挥的多重作用却不可忽视。目前，已有研究表明，ATⅡ在多个方面和IPF的进程相关[33]。

（一）促纤维化的环境以及其对ATⅡ和成纤维细胞的影响

IPF中涉及许多复杂的信号因子和途径，这些因子和途径协调肺纤维化的发病机制，导致促凋亡和促纤维化环境。TGF-β信号传导对于胚胎发育期间和成年期的形态发生是非常重要的。然而，在受损组织中，TGF-β1可充当主要的促纤维化细胞因子，诱导成纤维细胞募集，并促进肌成纤维细胞的增殖、分化以及ECM的沉积[34]。同时，TGF-β1作为纤维化重塑的关键参与者，不仅充当纤维细胞聚集、增殖和分化的重要促进者，也对体内ATⅡ具有重要作用。研究表明，肺泡腔中TGF-β1分泌增加可导致ATⅡ顶膜表面积减少，基底外侧表面积增加，发生极化，从而降低肺的顺应性[35]。这种ATⅡ与间质成纤维细胞之间的失调串扰被证明对于纤维化重塑的进展具有重要意义[36]。另外，关于ATⅡ和TGF-β还存在另一种影响，受损凋亡的ATⅡ可表达更多的上皮细胞整合素αvβ6，而上皮细胞整合素αvβ6可以诱导潜在的TGF-β复合物发生构象变化，又通过以上途径促进纤维化[33]。

溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid，LPA），是一种具有生物活性的脂质，可通过LPA1受体介导外周肌成纤维细胞的迁移以及弹力蛋白的合成，在肺部发育和衰老中十分重要。目前研究显示，在IPF患者支气管肺泡灌洗液中LPA水平与正常人相比升高，LPA可能作为促凋亡信号传导的因子促进ATⅡ的凋亡，并且可保护成纤维细胞不受细胞凋亡的影响[37]。

（二）起始事件：ATⅡ损伤引起促纤维化级联反应

尽管免疫抑制剂在临床上对IPF的治疗没有影响，但对上皮的损伤通常在肺中引发免疫应答。当ATⅡ损伤后，受损的上皮可释放多种趋化因子，如RANTS、MCP-1以及GM-CSF，这些趋化因子能够将炎性单核细胞、嗜中性粒细胞等募集到损伤部位。在单一损伤中，例如感染或过敏原暴露，单核细胞分化成巨噬细胞，吞噬纤维蛋白凝块而中性粒细胞可去除碎片并杀死入侵细菌。但在重复损伤的情况下，例如在IPF中，中性粒细胞和巨噬细胞不能足够快地消除，它们的存在不仅可加剧炎症反应，还可连续产生活性氧（reactive oxide species，ROS）从而加剧纤维化[38-39]。据Günther等[40]报道称，巨噬细胞移动抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）治疗可减轻模型小鼠的肺纤维化，这表明上皮细胞的损伤引起巨噬细胞聚集在肺纤维化的进程中十分重要。另外，Cao等[41]发现，在纤维化中，聚集在血管周围巨噬细胞，可阻碍ATⅡ的增殖，使修复进程向纤维化的方向发展。

除了中性粒细胞、单核细胞外，其他一些因损伤而聚集的先天性髓样细胞，例如Th1、Th2、Th17、Treg也被认为在肺中具有促纤维化作用[38]。研究发现，肺中募集的Th2可分泌白细胞介素-13（interleukin-13，IL-13）直接促进纤维细胞的增殖和上皮细胞的凋亡，并且选择性刺激和激活转化生长因子 β（transforming growth factor-beta，TGF-β）从而诱导组织纤维化。同时，Th1分泌的干扰素γ（Interferon-γ，IFN-γ）也被认为在肺纤维化中具有重要作用[42]。另外，过度的炎症细胞募集进一步加强血管内皮的损伤，凝血级联中活化的血小板释放可促纤维化因子如血小板衍生生长因子和TGF-β1加重纤维化的发生[43-44]。再者，Yang等[45]还发现，损伤后的小鼠ATⅡ细胞会产生过多的Ⅰ型胶原蛋白，这与炎症的消退有关。并且过多的Ⅰ型胶原蛋白可通过胶原蛋白受体盘状结构域受体，直接激活成纤维细胞，导致基质蛋白产生过量。总的来说，ATⅡ的损伤引起的渗出物和肺泡腔内凝血级联的激活，形成临时基质。后者由成纤维细胞和肌成纤维细胞侵入，在促纤维的环境下不断聚集、激活，产生更多的ECM。

（三）肌成纤维细胞的聚集与ATⅡ

肺泡上皮损伤激活成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，然后形成特征性成纤维细胞灶，分泌过量的ECM被认为是纤维化的过程。肌成纤维细胞作为纤维化过程中关键因素，近年来备受关注。关于肌成纤维细胞的来源，目前主要有三种假说。一种是来源于局部的成纤维细胞，据报道称，损伤发生后，在血小板分泌血小板衍生生长因子和来自上皮的TGF-β、肿瘤坏死因子α的作用下（ATⅡ可能是其主要来源），局部成纤维细胞向损伤部位的迁移，并分化为肌成纤维细胞[46]。由于细胞彼此接近，这种假设非常有吸引力，静息的常驻成纤维细胞可以立即暴露于响应损伤而分泌的细胞因子和趋化因子的环境中而被激活。然而，这种情况可能是初始爆发的原因，在肌成纤维细胞接管的大面积肺纤维化中可能不足。第二种理论认为，肌成纤维细胞可能来源于循环CXCR4阳性纤维细胞（或循环间充质细胞），这些细胞通过上皮细胞（包括ATⅡ）中趋化因子CXCL12的高表达而被吸引到肺部[47]。Heukels等[48]发现在IPF患者的血液中具有更多的循环纤维细胞，这是该理论的有力证据。第三种来源的理论是上皮-间质转化，既上皮细胞通过失去一些特征性的上皮表型，如E-钙黏蛋白，或者通过去分化表达一些肌成纤维细胞的标记物如α-平滑肌肌动蛋白和纤维连接蛋白等。目前，研究发现上皮-间质的转化可能涉及的关键途径是Wnt信号通路，并与ATⅡ关系密切。据报道，在过表达WNT-1诱导信号蛋白或WISP-1的ATⅡ中，一些促纤维化标志物的分泌增多，如MMP-7和纤溶酶原激活物抑制物 1（PAI-1），这些标志物可在相邻上皮细胞中诱导上皮-间质转化[49]。

总之，IPF是一种严重影响肺部结构和功能的疾病，且其发生和发展过程十分复杂。ATⅡ作为维持肺的结构和功能的关键细胞，在肺纤维化的发生和发展中极其重要。异常衰老、凋亡的ATⅡ不仅被认为是纤维化发生的始动因素，并且能在之后的各个环节对其进程产生影响，这其中包括临时基质的形成、成纤维细胞的聚集、活化，间质-上皮的转化等等。目前，已有大量的研究证明ATⅡ在IPF中的重要作用。同时，也逐渐有许多针对其特殊改变的新药被发现。但是，何种原因导致ATⅡ发生异常的衰老凋亡，其异常的衰老凋亡的机制又是何种原因并不完全清楚。并且，异常衰老凋亡的ATⅡ除了通过分泌趋化因子的方式引发免疫反应，聚集、激活成纤维细胞，是否还有通过直接接触等方式促进纤维化，成纤维细胞反过来对ATⅡ衰老和凋亡的异常又有何种影响，这些改变有哪些可以成为临床治疗的靶点等问题都需要进一步探究。不过，总的来说，当前关于IPF的各项研究正在如火如荼的进行，随着对其发生发展机制的不断探究，相信不久的将来，IPF的治疗一定会更上一个台阶。