外泌体在心血管疾病诊断和治疗中的作用研究进展

路芳芳 翁震 何杨

215006 江苏省血液研究所 苏州大学附属第一医院

外泌体(exosomes)是由细胞衍生的囊泡，1983年首次由Pan和Johnstone[1]在哺乳动物成熟的网织红细胞中发现。它是一种微小膜泡，具有脂质双分子层结构，内部包含蛋白质和核酸等多种物质[2]。大多数细胞，如间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)、内皮细胞、血小板、单核/巨噬细胞和心肌细胞等均能释放大小、组成及功能不同的外泌体。它可参与细胞间通讯、物质转运和交换等生理过程，故能够发挥调节细胞功能的作用。不仅如此，近年研究表明外泌体还参与到多种疾病的发生和发展过程中，包括肿瘤、机体免疫应答、神经退行性疾病和代谢综合征等。

在心血管疾病中，有关外泌体的研究进展迅速，多项研究表明它能够参与到各种心血管疾病的发生发展过程中，特别是在动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)、心力衰竭和心肌梗死等病理过程中发挥着重要作用。外泌体自身的组分会随着胞内物质的释放及内环境的变化而发生特异性的改变，这些特征为其作为疾病的诊断工具提供了可能性。此外，近年研究发现各种干细胞、血小板、内皮细胞等衍生的外泌体在促进血管再生和修复受损心脏等方面发挥着重要的作用。本文主要对外泌体的产生和其对心血管疾病的诊断和治疗作用方面的研究进展进行综述。

1 外泌体的生成

外泌体由晚期的核内体生成，随后通过许多不同的途径形成多泡体，其中最典型的是ESCRT依赖途径。ESCRT能够识别泛素化的蛋白质，目前已知有4种不同的ESCRT复合物。ESCRT-0复合物的亚基能够招募内化的蛋白质，如泛素化蛋白质和网格蛋白等。ESCRT-1和-2决定萌芽过程的开始，能促进所携带的蛋白在腔内囊泡形成之前进行去泛素化，然后腔内囊泡在细胞内隔室中形成更大的多泡体。ESCRT-3复合物驱动最后阶段的膜内陷和分离[3- 4]，之后通过胞吐作用形成外泌体。外泌体可通过两种机制从细胞释放：组成型或诱导型。组成型分泌途径受某些RAB小G蛋白(Rab27a/b，Rab11和Rab35)、异源三聚体G蛋白、WNT5A和糖鞘脂等调节[5]；而诱导型分泌受应激刺激的调节，包括异常细胞内钙释放、DNA损伤、缺氧和脂多糖等的刺激[6-7]。此外，Gu等[8]的研究表明，在造血干细胞中，空泡蛋白分选蛋白33B能够调节外泌体的分泌和成熟以及外泌体内蛋白的分泌，从而影响造血干细胞的功能和白血病的发生。进一步的研究表明，外泌体的作用机制是通过空泡蛋白分选蛋白33B与鸟苷二磷酸分解抑制剂2相互作用共同完成的。

2 外泌体在心血管疾病中的诊断和治疗作用

外泌体在多种疾病的发生和发展中都具有重要作用。近年广泛开展了有关外泌体在肿瘤的诊断和治疗、靶向给药及心血管疾病的诊断和治疗中的作用研究。在心血管疾病中，迄今为止，大多数研究主要集中在源自体外培养的多能细胞产生的外源外泌体的功能上。关于内源性外泌体的作用，近来已有文献报道，来自血清的外泌体可以防止心肌缺血-再灌注损伤[9]。为了阐明血清外泌体在急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)中是否也有类似作用，Gu等[10]建立了新生大鼠原代心肌细胞氧-葡萄糖剥夺和再灌注模型，将纯化的人或小鼠血清外泌体与大鼠心肌细胞共培养，发现外泌体能显著减弱缺氧缺葡萄糖引起的心肌细胞凋亡。体内小鼠AMI模型也证实，血清外泌体可以通过增加miR-21的表达来减少小鼠心肌梗死面积[11]。此外，Li等[12]研究发现，血清外泌体可通过miR-939-iNOS-NO途径促进心肌缺血患者的血管生成。

2.1 外泌体在心血管疾病中的诊断作用

2.1.1 AS AS是一种慢性炎症性疾病。在AS形成期间，外泌体携带有来自其亲本细胞的表面分子及特定的胞质内含物，根据这些表面分子和内含物的不同，外泌体可以作为AS诊断和预后的生物标记物。最新研究发现，动脉粥样硬化性脑血管疾病患者血浆中的内皮细胞和血小板衍生的外泌体含量显著升高，其中的蛋白质如血小板糖蛋白Ⅵ、整合素连接激酶1等也会发生改变，这对AS具有潜在的诊断价值[13-14]。Fichtlscherer等[15]报道，与健康对照组相比，冠状动脉粥样硬化性心脏病患者的外泌体中miR-126、炎症相关miR-155和平滑肌富集miR-145降低。Bi等[16]研究表明，AS进展为急性冠状动脉综合征(acute coronary syndrome，ACS)后，患者的血清外泌体中miR-208a表达显著上调，并且这部分患者的生存率降低，提示外泌体miR-208a可能有助于ACS的早期诊断和预后判断。此外，不稳定斑块患者血循环中白细胞衍生的外泌体水平的增加可作为提示斑块易感性的指标，并能够鉴别具有高风险斑块破裂的无症状个体(CD11b+/CD66+外泌体)[17]或预测未来不良心血管事件的发生(CD3+/CD45+外泌体)[18]。

2.1.2 心肌梗死 心肌梗死是冠心病的严重类型，可造成心肌细胞不可逆的损伤，最终导致心力衰竭。心肌梗死患者血液中的外泌体miRNA可作为心血管疾病诊断的生物标记物。Min等[19]研究发现，ST段抬高型心肌梗死患者冠状动脉内和全身循环微泡水平升高，在经皮冠状动脉介入治疗后，局部增加的内皮和血小板衍生的微泡水平显著降低，进一步表明循环微泡水平可反映心肌梗死情况。另有研究证实，AMI患者的血清外泌体中miR-30a水平升高，HIF-1α在缺氧条件下上调[20]。动物实验显示，心肌梗死小鼠模型中miR-1和miR-133a的水平明显降低，这些miRNAs可能是心肌梗死早期诊断的标记[21]。Cheng等[22]在AMI大鼠的尿外泌体中检测到心脏富集的特异性miR-1和miR-208，表明心肌梗死发生后，外泌体可能从心脏转移到了肾脏然后进入尿液，这为AMI的诊断又提供了一组潜在的尿液生物标记物。

2.1.3 心力衰竭 AMI不断发展，导致大量的心肌细胞死亡并最终发展为心力衰竭。Goren等[23]和Tian等[23-24]的研究报道，特异性miRNA如miR-423-5p、miR-27a、miR-28-3p和miR-92b水平升高，可用于鉴别收缩性心力衰竭。另有证据表明，特定的外泌体相关miRNA对心力衰竭具有调节作用[25]。为了鉴定可以作为患者AMI后缺血性心力衰竭的可靠预测因子的循环miRNA，Matsumoto等[25]筛查了AMI后1年内发生缺血性心力衰竭的21例患者，在被检测的377个miRNAs中，仅有循环p53反应性miRNAs，包括miR-192、miR-194和miR-34a的水平显著上调。此外还发现，miR-192、miR-194和miR-34a在外泌体组分中高度富集，实验结果提示基于外泌体的循环p53反应性miRNAs(miR-192、miR-194和miR-34a)可能是AMI后发生缺血性心力衰竭的预测因子。

2.2 外泌体对心血管疾病的治疗潜力

2.2.1 MSCs来源的外泌体 MSCs是一类多能干细胞，存在于骨髓、肌肉等多种组织中。MSCs衍生的外泌体通过其内容物中的蛋白质、RNA等成分的胞间转移来促进组织修复和血管新生。目前研究表明，人胎盘来源的MSCs释放的外泌体中含有血管内皮生长因子和miR-126，能够促进血管生成，特别是在一氧化氮刺激下，其促进血管生成的能力显著增强[26]。Lai等[27]研究发现，人类MSCs分泌的外泌体在缺血/再灌注损伤的小鼠离体模型中减少了心肌梗死面积。进一步的研究表明，在小鼠体内实验中，用MSCs来源的外泌体进行全身预处理后，显著提高了ATP和NADH的水平，减少了心脏组织中的氧化应激。Jill等[28]研究发现，骨髓MSCs来源的外泌体能够有效治疗辐射导致的造血功能衰竭，而这种作用不依赖于造血干细胞移植。Cheng等[29]将MSCs的细胞膜包被到负载MSCs分泌因子的PLGA颗粒(一种可降解的生物相容性材料)上，制成一种性质稳定的人造MSCs外泌体，将其注射到小鼠AMI模型中，发现其能够促进血管生成并减轻左心室重构。

2.2.2 血小板来源的外泌体 血小板在体内主要发挥生理性止血和促进血栓形成的作用，但近年来发现，血小板活化后衍生的外泌体具有抑制新生内膜和血栓形成的作用。Mause等[30]的实验发现，血小板衍生的外泌体与血管早期生长细胞相互作用，从而促进内皮再生和抑制血管损伤后新生内膜的形成，这提示其可能对AS和血管再狭窄等具有治疗潜力。其主要机制涉及增强血管早期生长细胞募集、迁移、分化和释放促血管生成因子。此外，血小板衍生的外泌体还能抑制血栓形成。Srikanthan等[31]研究发现，激活的血小板衍生的外泌体可通过增强CD36的泛素化和蛋白酶体降解来快速减少血小板中的Ⅱ型清道夫受体CD36，导致血小板聚集的减弱和离体胶原基质的粘附，并抑制FeCl3介导的动脉损伤模型的血栓形成。已知miR-126是调节血管生成的最重要的miRNAs之一。Sun等[32]通过对ACS患者斑块内血小板外泌体水平的探讨，发现活化的血小板衍生的外泌体能促进人脐静脉内皮细胞的增殖和迁移，以及miR-126和血管生成因子的过表达，从而阐明了斑块内血管生成的潜在治疗靶点。最近一项研究发现，血小板来源的外泌体会选择性释放一种环状RNA[33]，提示除miRNA外，还有另一种RNA也参与到了与血小板有关的病理生理过程中，血小板外泌体环状RNA的诊断和治疗潜力值得进一步研究。

2.2.3 内皮细胞来源的外泌体 内皮细胞释放的外泌体对血管生成和炎症具有重要的调节作用。已有研究表明，通过将miR-126-3p和pSTAT转移到受体内皮细胞中导致ERK1-/-2活化，内皮衍生的外泌体可以促进血管生成[34]。与此相一致的是，外泌体还可通过旁分泌调节相邻内皮细胞增加血管生成，并通过β1-整合素途径Rac1-ERK1-/-2ETS1发出信号以形成新的血管[35]。目前发现，几种miRNAs可能通过抑制促炎性核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)转录通路，发挥调节内皮细胞功能和抑制血管炎症的作用。例如，miR-146a靶向衔接蛋白以抑制NF-κB信号传导[36]，而miR-10a抑制NF-κB不稳定蛋白的表达[37]。这些miRNAs可能在抑制内皮细胞激活中起到互补作用。值得注意的是，血管内皮细胞募集循环单核细胞到血管损伤和(或)感染的区域[38]，进入血管壁后，单核细胞分化为巨噬细胞，通过释放外泌体以驱动炎症反应来中和入侵的病原体，修复组织损伤或激活免疫细胞[38]。

2.2.4 其他细胞来源的外泌体 除上述几种细胞来源的外泌体外，其他一些细胞衍生的外泌体也在心血管疾病中显示出重要的治疗潜力。例如，树突状细胞来源的外泌体可通过内分泌机制介导CD4+T细胞的活化，改善心肌梗死后的心脏功能[39]；细胞外基质来源的外泌体携带的miR-199a-3p通过抑制同源域蛋白(HOPX)表达和增加GATA结合4(Gata4)乙酰化，促进分离的新生儿心肌细胞和窦结节细胞的生长。在窦性淋巴结功能障碍的动物模型中，miR-199a-3p可以改善心肌细胞的电生理功能[40]；脂肪细胞来源的外泌体可通过调节泡沫细胞的形成和极化而发挥致AS的作用[41]。

3 小结与展望

综上所述，外泌体可作为一种指示子来反映AS和心肌梗死等多种心血管疾病的发生发展和严重程度。此外，干细胞、血小板、内皮细胞等释放的外泌体在促进血管生成、改善心肌梗死和抗AS中发挥着重要作用。随着精准医学概念的提出，越来越多的人开始关注如何能做到疾病的精确诊断和治疗。各种证据表明，外泌体有望成为疾病诊断治疗的潜在有效方式。外泌体中含有miRNA等多种内含物，很多内含物对机体的作用还有待进一步研究，应从外泌体的分离和提纯入手，进一步优化外泌体的提纯方法，以便为后续的鉴定和功能的研究提供良好的基础，使外泌体早日应用于心血管疾病的临床诊断和治疗。

利益冲突：无