原发性肝癌局部治疗与免疫相关动物模型的选择*

陈晓琦 陈欣菊 赵 晴 邝玉慧 冀爱英

河南中医药大学第一附属医院消化科 (河南 郑州， 450003)

局部治疗是一种微创治疗方法，如热消融或肝动脉介入栓塞直接治疗肿瘤。这些常用的治疗原发性肝癌的方法不仅会导致肝癌细胞死亡，还会引发肿瘤细胞的免疫反应。本文对局部治疗与癌症免疫学之间的联系进行综述，并讨论了动物模型研究相关的问题，以促进此领域的快速发展。

1 肝癌局部治疗动物模型的研究

动物模型使实验性药物和免疫调节剂的临床前优化先于人体试验。当系统给药时，具有潜在致命毒性的新药物在动脉内或肿瘤内局部给药应首先在临床前进行测试。在临床前动物的生存模型中，可以多方面对生物标志物取样，而且不需要担心辐射暴露。

诱导小鼠肿瘤形成的方法有多种，包括基因工程、小鼠模型、趋化剂、肝内或脾内注射肿瘤细胞和肿瘤移植。此外，由于原发性肝癌(HCC)通常是在肝脏原有病变的情况下发生的，所以可以采用诱导小鼠肝脏疾病的方法来模拟病毒性肝炎、脂肪肝、肝纤维化、酒精引起的肝病和胆汁淤积[1]。此外，人性化小鼠可能具有潜在模仿人类免疫反应的作用，然而这项技术是有挑战性的，目前尚未被肝癌免疫治疗领域采用。

研究者对肝癌免疫系统机制的了解大部分来自于小鼠模型实验。小鼠模型具有吞吐量优势，可对大量动物进行处理，饲养简单，成本较低。然而,由于规模的差异，体型成为研究局部治疗和药物输送的劣势。研究人员对局部区域技术的建模和应用的能力有限，所以皮下肿瘤的消融只能在相对小而圆的肿瘤上进行，以防止皮肤烧伤和对周围组织的损伤，且可能危及动物的神经。在小鼠和大鼠模型中，由于血管口径小，动脉内给药非常具有挑战性。通路血管和肝内靶向血管均小于标准临床器械和侵入性成像设备。与人类或大型动物血管相比，特定的微球大小可能有非常不同的生物效应。此外，由于纯粹的几何形状和比例，在小鼠模型中还缺乏用于实时指导动脉内治疗过程的造影剂。用于人体的造影剂是非离子型和水溶性的，从小鼠血液中清除太快，不能在程序时间内高分辨率成像，而静脉超声造影剂还不能满足动脉期信息的需要。

至少有3个动物模型可以模拟局部治疗，并用于研究介入肿瘤学对肝癌的影响。兔VX2模型已广泛应用于肝肿瘤的各种消融技术和动脉内给药[2]。然而，该模型对免疫学研究有较大的局限性。首先，VX2是一种由乳头状瘤病毒诱导的野兔间变性鳞状细胞癌细胞系，在组织学和遗传学上不像大多数人类HCC亚型[3]。细胞在供体动物的肌肉中增殖，监测肿瘤体积是否足够，然后进行肿瘤切除，切除坏死部分，仅将存活的肿瘤细胞移植到动物体内。这些VX2细胞可以移植到不同的位置，如侧翼、肝脏、肺和肾脏。移植技术导致了该模型在免疫学研究中的第二个局限性，即移植兔与被移植兔的基因不相同。因此，肿瘤可以被认为是同种异体移植，而不是自体移植物。受体动物有可能将肿瘤细胞识别为非自身，并表达排斥或改变免疫反应。第三，植入前去除坏死部分可能出现删除抗原或干扰免疫应答的反应。最后，植入的VX2肿瘤不太可能再现人类HCC微环境。VX2肝肿瘤随着周围血管的增多而进化和生长，而中心区域可能由于供血不足或其他未知原因发育为中心型或异质性坏死。这可能会阻碍抗原识别或呈现，随后免疫细胞出现非过滤性坏死。这不仅会影响药物疗效和对安全性的研究，也会限制对局部或局部治疗后免疫调节的认识。与人类肿瘤不同，VX2肿瘤的异质性有一定的局限性，免疫通路的激活或逃逸可能缺失、模型不完善或被忽视。

近年来，为了研究介入肿瘤学范式，引入了两种HCC模型，即大鼠和土拨鼠，前者由毒素二乙基亚硝胺(DEN)诱导，后者由土拨鼠肝炎病毒诱导。这两种模型和大多数人类肿瘤一样，肿瘤是在肝脏疾病纤维化或慢性炎症的背景下自发形成的。肝脏是一种对病原体、益生菌和食物源抗原具有耐受性和有效反应的器官，考虑到肝脏的免疫学特性，原位模型可能优于其他模型[4]。一项总结分析研究发现，在动物模型中，致癌物诱导的肿瘤与临床反应之间存在生物相关性[5]。不同小鼠肝癌的表现已经表明,肿瘤至少与人类疾病相似,而且发现人类肝细胞癌几乎普遍携带Braf V637E突变。随着粘附性和肥大性动脉供血的发展，肝内肿瘤的逐渐生长可能会导致更好的建模，这种供血类似于人类HCC，并可能促进与免疫系统之间的相互作用。土拨鼠肝癌模型可发展出大的、血管过度浸润并可选择靶向治疗的肿瘤，用于新疗法和介入肿瘤学区域内治疗研究。该模型的肿瘤异质性和遗传变异有待进一步研究，但可以为肝癌的新治疗研究提供最新的模型。

2 细胞死亡和抗肿瘤免疫

细胞死亡如何影响肿瘤免疫已被学者广泛研究。受细胞死亡影响的免疫机制主要有3种:肿瘤抗原、抗原递呈细胞和效应细胞。临床前研究增加了学者对免疫系统如何对局部治疗和随后的细胞死亡做出反应的理解。众所周知，细胞死亡的类型对抗肿瘤免疫有显著影响。相关研究模型使用3个冷冻解冻循环(冷冻消融)或伽玛辐照来杀死肿瘤细胞，诱导肿瘤特异性免疫，证明了细胞凋亡，而不是坏死的肿瘤细胞死亡。有趣的是，病原体相关的分子模式类似物，如p(dI-dc)和/或未甲基化的合成DNA能够诱导免疫应答，即使是对肿瘤细胞裂解物的应答[6，7]。进一步的分子研究表明，坏死的肿瘤细胞死亡不能诱导抗肿瘤免疫，这是由于冻融细胞中寡肽酶的活性所致[8]。抗原启动免疫应答的存在和过程机制可能受细胞死亡或细胞损伤的类型、抗原提呈细胞的必要分子伴侣、调节性T细胞的供应以及附近血管供应链的邻近性的控制。这种复杂的动态分子交互过程很难用简单的线性因果描述规则来描述。动物模型不能再现人类肝癌发生的药理学免疫调节的复杂而动态的免疫过程。

显然，细胞在体内死亡的情况更为复杂。有学者研究了化疗诱导细胞死亡的作用及其对肿瘤免疫的影响，认为初始刺激可导致免疫原性或非免疫原性细胞死亡。免疫原性细胞死亡涉及释放钙网蛋白等内质网的蛋白质在细胞表面,在起泡阶段三磷酸腺苷分泌的细胞凋亡,细胞死亡率释放非组蛋白的染色质蛋白高移动率组1 促进补充和激活树突状细胞进入肿瘤微环境,这将允许垂死的肿瘤细胞吞噬肿瘤抗原，并将最佳抗原呈现给T细胞。已知诱导和增强免疫原性细胞死亡的化疗药物包括阿霉素和奥沙利铂，而顺铂不能诱导免疫原性细胞死亡；阿霉素是肝细胞癌化疗栓塞中最常用的药物，其在肝细胞癌图像引导区域治疗中的应用具有广泛的意义[9，10]。

在实验小鼠模型中，细胞死亡的类型不仅决定了免疫效果，也决定了肿瘤的类型。最近研究显示，凋亡相关的肝细胞因子微环境决定了肝癌是否从癌基因转化的肝细胞中生长出来，而含有相同致癌驱动因子的肝细胞如果面临坏死微环境，则会导致肝内胆管癌(ICC)。抑制坏死的药理学或遗传学可逆转坏死依赖的细胞因子微环境，并将ICC转换为HCC[11]。

2003年，局部治疗对抗肿瘤免疫作用的首批研究之一，报道了肿瘤特异性T细胞在VX2肿瘤模型兔射频消融后活化。射频和低温消融已被证明可为体内树突状细胞提供抗原来源。射频消融术可增强体内肿瘤特异性免疫应答，使树突状细胞在射频消融作用下浸润肿瘤，并可通过脾细胞转移至幼稚小鼠体内赋予免疫。这些机制主要通过上调抗原表达来发挥作用。热消融(经皮射频消融、微波消融、冷冻消融和不可逆电穿孔)对免疫反应的影响是颇有见解但有些推测性的综述的主题[12，13]。

3 动物模型中不同的免疫基础方法与区域定位疗法的结合

在动物模型中可以评估不同的免疫基础方法与区域定位疗法的结合。使用一种定义明确的小鼠B16-OVA肿瘤模型，ctla4阻断抗体是在此环境中测试的首批化合物之一。研究证明，它不仅对OVA有微弱但可检测的免疫反应，而且对更广泛的B16抗原也有免疫反应，这一效应的意义在过继转移实验中得到了证实。在过继转移实验中，将RFA消融后小鼠脾细胞转移到具有活肿瘤细胞的小鼠体内。抗ctla治疗时肿瘤破坏增强抗肿瘤免疫。在临床前小鼠前列腺癌模型中也观察到类似的结果。抗ctla4治疗增强了冷冻消融的效果，导致继发性肿瘤生长受损[14]。RFA和TLR9联合刺激在VX2肝癌模型中进行实验，结果显示联合刺激可预防后续肿瘤扩散。类似的结果已经在B16-OVA模型联合冷冻消融和通过CPG-低聚核苷酸刺激TLR9的联合治疗中获得，由于树突状细胞成熟增强导致肿瘤小鼠更有效的交叉表达，该联合治疗在根除局部和全身肿瘤方面非常有效[15]。

光动力疗法(PDT)使用无毒光敏剂和无害可见光与氧气结合产生细胞毒性活性氧，通过细胞凋亡和/或坏死选择性杀伤恶性细胞，关闭肿瘤微血管，保留正常组织。它可引起急性炎症反应、休克和免疫细胞浸润，从而诱导免疫原性细胞死亡。PDT已被证明可以防止远处未治疗肿瘤的生长，并以CD8+T细胞依赖性的方式防止小鼠肿瘤再挑战。抗ctla4治疗显著提高了小鼠的治疗效果和存活率[16]。与Toll样受体-7激动剂咪喹莫特 (R837)联合使用聚乳酸-乙醇酸(PLGA)与光热剂共囊包封时，也可观察到类似的结果。联合抗ctla4治疗小鼠产生强烈的免疫反应可抑制转移形成，导致肿瘤缩小。IL-2以融合蛋白的形式与肿瘤特异性抗体结合，被证明可以增强对经射频消融治疗的结肠肿瘤的抗肿瘤免疫[17]。

不足量的射频消融也被证明可以通过HIF-1a/VEGFA促进残余肝细胞癌的血管生成和非小细胞肺癌细胞的肿瘤生长。射频消融还可以通过IL6、c-met或hgf依赖的途径诱导肝再生和肿瘤发生[18]。尽管如此，单独或联合调节射频加热参数，辅以热休克蛋白抑制、STAT3抑制或简单的环氧化酶-2选择性非甾体抗炎药物可以减轻或减少不必要的、非靶向的全身致瘤作用[19]。然而，在部分消融或栓塞诱导致瘤反应与免疫退行性之间，可能存在着一种不稳定且难以理解的平衡。通过药物调节打破这种平衡可能会更充分地了解HCC。