胃癌循环肿瘤细胞检测研究进展

王 猛，李 晨，顾萍萍，谭 琳，刘 霞，周永坤

循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）被认为是从肿瘤原发部位和转移部位进入血液循环的各种类型的肿瘤细胞。早在1869年，澳大利亚医生Ashwonh等在癌症患者外周血中发现并首次提到了CTCs的概念[1]。CTCs具有癌症干细胞（cancer stem cell，CSC）的特征，有很强的自我更新、分化能力，并且有致瘤能力和转移能力等特征。早期的观念认为，当肿瘤恶化或进展时会发生转移，但越来越多的证据表明肿瘤的扩散可能在早期发生。在原发肿瘤形成之前甚至可能发生远处转移[2]。CTCs被认为是致肿瘤远处转移的主要原因。检测外周血中的CTCs方便无创、敏感度高，具有可重复检测性，美国 FDA 认证该检测为目前最可观的检测手段之一。CTCs可以比影像诊断更早地预测肿瘤细胞的微转移，然后指导肿瘤的早期诊断。随着科学技术的进步，CTCs的研究越来越深入，已成为目前研究的热门内容。胃癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，CTCs 检测技术对胃癌的早期诊断和早期治疗具有重要的意义。本文将总结近年来CTCs 的检测技术，探讨其在胃癌诊治中的应用价值。

1 CTCs的检测

CTCs检测被称为“液体活检”，能够减少侵入组织取样需求的机会。在肿瘤治疗的基础研究和临床应用方面具有很大的潜力；在肿瘤复发和预后的作用受到越来越多的关注。由于肿瘤患者外周血中CTCs的数量非常少，浓度通常仅为1～10个/10 mL[3]，这要求检测人员在短时间内采用高灵敏度和特异性的检测方法。目前CTCs富集方法包括根据物理性质、免疫学原理和微流体装置等。不同类型肿瘤的CTCs具有相对类似的物理学特征(如密度、电荷、大小和可变形性)和表面标记，这些特征与血细胞不同[4]。

1.1 Cell Search系统检测技术 Cell Search系统检测是将免疫荧光标记与免疫磁珠分选富集技术相结合，是世界上比较先进的检测技术。具有灵敏度高，可重复性强，有特异性和自动化程度较高等特点[5]。使用Cell Search系统从外周血检测到的CTCs对预后的评估具有重要的参考价值，还可能预测胃癌患者对化学疗法的不良反应[6]。

1.2 楔形微流体芯片检测技术 楔形微流体芯片（名为CTC-ΔChip）用三色免疫细胞化学方法（CK+/CD45-/Nucleus+）鉴定标记CTCs，在癌症患者血液样本量较少的情况下，也能检测到CTCs，在胃癌患者的诊治中具有重要的临床意义。CTC-ΔChip具有低成本，大批量生产的优点，在未来指导癌症治疗和预后监测中具有很大的临床应用潜力[7]。

1.3 基于肿瘤选择性复制单纯疱疹病毒的技术 基于肿瘤选择性复制单纯疱疹病毒的技术，是根据端粒酶特异性，来复制选择性溶瘤性疱疹病毒-1，使靶向端粒酶-逆转录酶阳性癌细胞能表达绿色荧光蛋白，借此来鉴定CTCs。与Cell Search相比，该试验在40例非小细胞肺癌患者中具有较高的阳性率[8]。

1.4 针状细胞传感器检测技术 针状细胞传感器检测技术，直接在血液中检测和捕获CTCs，而不改变遗传信息，允许血液的整个循环通过细胞传感器。本检查方法灵敏度高，检测CTCs的能力可达102～106个细胞/ mL，还能避免细胞信息的扭曲[9]。

1.5 阴性富集和免疫染色-FISH检测技术 Li等[10]使用阴性富集和免疫染色-FISH提高循环肿瘤细胞的敏感性和特异性，结合负浓缩、免疫细胞化学CD45染色和荧光原位杂交来鉴定、表征CTCs。肺癌、胃癌、乳腺癌和食管癌的阳性率分别为71.33%、86.21%、76.77%和78.35%。此外，CTCs可在Ⅰ期检出，肺癌阳性率为64.15%，胃癌阳性率为83.33%，乳腺癌阳性率为78.95%，食管癌阳性率为68.18%，可促进早期诊断，影响治疗决策。

1.6 微流控芯片检测技术 微流控芯片技术具有低成本、速度快、高通量、操作简单的优点。微流控芯片技术集成了样本预处理和分析程序，简化了对微小芯片的检测。检测过程可实现自动化，其核心原理是将硅、玻璃或聚二甲基硅氧烷通过微加工，制造具有微米量级的不同结构和尺寸的管道用于细胞分选。捕获和富集是CTCs技术的关键所在，目前已经开发了多种微流控芯片平台[11]。使用这种单细胞回收装置，不仅可以通过检测单细胞水平的遗传畸变，还可以通过跟踪在抗癌治疗期间变化来实施个性化治疗，而且能够用于活性细胞回收[12]。

1.7 关于CTCs标本的保存 关于收集的CTCs血液标本的保存，Brungs等[13]比较冷冻保存的标本（2周到25.2个月，中位数14.6个月）及新鲜标本（24 h内）CTCs检测情况。发现尽管与冷冻保存标本相关的CTCs数量有明显减少的趋势。但这主要是在总CTCs计数＞ 50的样本中，低CTCs计数样本受影响小。冷冻保存时间和CTCs数量之间没有显着关联，冷冻保存延迟隔离是一种有效的策略，有助于样本收集，运输和处理。

2 CTCs检测在胃癌中的应用

CTCs检测在胃癌的早期诊断、评估胃癌术后预后、预测转移性胃癌的化疗反应、评估胃癌患者长期预后、评估晚期胃癌的治疗反应和预后、筛选胃癌靶向治疗可能获益的患者等方面具有重要的作用。同时,构建了CTCs动物模型，为进一步研究奠定了基础。

2.1 CTCs在胃癌的早期诊断中的作用 作为生物标志物，CTCs在胃癌的早期诊断中具有潜在的作用。有研究[14]将116名接受胃切除术的胃癌患者和31名健康志愿者进行前瞻性研究。在胃切除术前收集外周血样本，使用离心微流控系统和新型液体辅助分离技术检查CTCs，检查的灵敏度和特异性几乎在每7.5 mL血液CTCs阈值2时优化。在每7.5mL血液中CTCs水平≥2的102名患者中，99名患有胃癌。在每7.5 mL血液中CTCs水平＜2的45名患者中，28名是健康对照。郭迎雪等[15]选择了80例胃癌患者、50例慢性胃炎患者和50名健康志愿者，治疗前抽取外周血7.5 mL用Cell Search 方法计数静脉血中CTCs 数目，发现胃癌患者CTCs计数显著高于慢性胃炎患者和健康人，与血清CA724水平成正相关。胃癌外周血CTCs计数与患者临床特征有一定相关性，并有望成为早期诊断胃癌的新的血液学指标。

2.2 监测胃癌术前和术后CTCs的变化评估预后 通过检测CTCs，评估可切除的胃癌的术前和术后CTCs变化以及可能与术后复发的相关性。Zhang等[16]研究发现，应用标准化的Cell Search系统检测胃癌患者CTCs，临床病理特征相对较差的患者有更多的术前和术后CTCs。CTCs≥5/7.5 mL患者，3年无病生存率（disease-free survival，DFS）显著低于CTCs ＜5 / 7.5 mL患者。术后血液中CTCs≥5/ 7.5mL的患者与其他患者相比，平均DFS和总生存期（overall survival，os）均短。根治性手术后不同临床分期胃癌患者的CTCs存在差异，术后2年复发转移情况存在差异。狄剑士等[17]研究60 例胃癌根治术患者外周血中CTCs，Ⅰ期阳性率9.1%，Ⅱ期阳性率33.3%，Ⅲ期阳性率64.3%，Ⅲ期阳性率与Ⅰ期、Ⅱ期的阳性率不同，Ⅰ期CTCs 阳性患者2年内未转移；Ⅱ期CTCs阳性患者6～12个月无转移，4例患者12～24个月出现不同程度的肝、肺、骨转移；Ⅲ期CTCs阳性患者6-12个月内肝转移1例，12～24个月出现肝脏转移2例、肝肺和骨同时转移3例、骨转移1例、肺和颅内转移1例，转移率Ⅲ期高于Ⅱ期和Ⅰ期。

2.3 CTCs预测转移性胃癌化疗反应 CTCs与转移性胃癌患者化疗反应不佳有关。Lee等[18]研究100名转移性胃癌患者，95名患者中的27名检测到5个或更多CTCs（CTCs阳性）。尽管CTCs阳性组和CTCs阴性组的临床特征没有显著差异，但CTCs阳性组对化疗有显著反应，CTCs阳性组的中位无进展生存期明显短于CTCs阴性组。对于总体存活，CTCs阳性组的存活率显著短于CTCs阴性组，CTCs阳性是无进展生存和总体生存的独立不利因素。

2.4 CTCs评估晚期胃癌患者预后 CTCs水平可能有助于评估晚期患者的治疗反应并预测其预后，治疗后CTCs的变化可能有助于快速识别无效治疗和不良预后[19]。Liu等[20]纳入59例化疗胃癌晚期患者，经多变量分析表明，化疗第一周期后CTCs计数的增加仅是无进展生存期（progression-free survival，PFS）差的独立预后指标。基线CTCs计数＞ 2细胞/ 5 mL血液是PFS和OS的独立不良预后标志物。在第一轮化疗后，基线CTCs计数低或CTCs计数降低的患者可能会从姑息性化疗中获益。有研究[21]在晚期胃癌患者中测定CTCs，鉴定出两种具有不同阈值的CTCs亚型，为多发性CTCs及多倍体+三倍体CTCs。在治疗最初6周后，多倍体CTCs增加≥10%的患者PFS和OS较差，治疗后多倍体CTCs增加≥10%是PFS和OS的唯一独立预测因子，CTCs的非整倍性与晚期胃癌患者的预后相关。朱莹等[22]将35例HER-2阴性晚期胃癌患者设为胃癌组，同时设良性胃病对照组 (20例) 和健康对照组 (20例)。在治疗前，取外周静脉血标本3.2 mL，采用免疫磁珠微粒阴性富集技术检测CTCs。胃癌组CTCs检测阳性率为31.4%，对照组均未检出CTCs，结果HER-2阴性晚期胃癌患者外周血CTCs检测结果与转移部位数目相关, 可用于预后评估。

2.5 CTCs评估胃癌患者长期预后 较低数量的CTCs与较高的无复发生存率（relapse-free survival，RFS）相关，可预测胃癌长期预后。Ito 等[23]研究，手术前从治疗阴性的胃腺癌患者中获取7.5 mL外周静脉血样，使用OBP-401检测CTCs，CTCs数量随着疾病进展而趋于增加。7.5 mL外周血中超过5个CTCs患者，OS低于5个或更少CTCs患者。在超过5的患者和具有5个或更少CTCs的患者之间，发现RFS的显着差异。

2.6 CTCs评估胃癌靶向治疗疗效 成功使用靶向治疗肿瘤的关键，是能够根据分子标记预选可能从治疗中受益的患者，而预测治疗反应的评估主要依靠肿瘤活检。Mishima等[24]将CTCs检测作为补充原发性肿瘤活检的一种非侵入性潜在策略，以期找到可能从曲妥珠单抗治疗中获益的患者，发现原发肿瘤为HER-2，但其CTCs显示HER-2扩增以选择可能受益于曲妥珠单抗治疗的患者。

3 CTCs在胃癌动物模型构建的作用

胃癌CTCs动物模型构建为CTCs在临床实践中的应用奠定了研究基础。周洲等[25]构建了4种胃癌裸鼠模型，包括皮下移植瘤、原位移植瘤、腹腔移植瘤、尾静脉移植瘤，检测各组肿瘤生长、转移水平，比较各组循环血中CTCs数目，并进一步行单细胞实时荧光定量聚合酶链式反应分析转移相关基因在CTCs与原细胞中的表达变化，免疫组织化学法检测肿瘤组织中血管的生成情况。发现胃癌细胞原位移植模型裸鼠死亡率低，肿瘤转移明显，CTCs数量明显高于其他造模方法，是研究胃癌CTCs的理想模型。

循环肿瘤细胞已被认为是包括胃癌在内的多种肿瘤的潜在预后指标；在癌症治疗的基础研究和临床应用方面具有很大的潜力；它提供了获得个性化药物开发所需的关键生物信息的机会。CTCs捕获提供了对癌组织的实时监测，而无需进行侵入性活组织检查，CTCs的研究是一个令人兴奋的研究领域。然而，目前的CTCs检测方法在特异性和敏感性方面面临着严峻的挑战，现有的CTCs隔离装置的制造工艺复杂且材料昂贵。因此，迫切需要开发一种新的平台，以降低成本，大规模高性能实现CTCs检测。在临床中，CTCs被认为在癌症转移中具有关键作用，胃癌患者的死亡主要是由于其复发和转移。而CTCs是转移的必要条件，进行治疗前和治疗后监测CTCs，可用于早期检测亚临床患者或疾病复发，预测肿瘤进展和辅助化疗的效果。CTCs检测对胃癌的诊断、治疗和预后具有重要意义。