病态窦房结综合征相关基因的多肽性研究

范宁 任明

在正常生理状态下，由窦房结来主导整个心脏的节律性活动，当窦房结发生病理改变或生理功能受损时，临床上会出现心律失常和临床综合征（窦性心动过缓、窦房阻滞、窦性停搏和心动过缓-心动过速综合征），称之为病态窦房结综合征。引起病态窦房结综合征的原因有很多，特发性硬化、冠心病、心肌病、心肌炎、风湿性心脏病、外科手术、高血压病等基础疾病均可引起病态窦房结综合征。近年来研究发现，有很多不伴有器质性心脏改变的人群也会产生病态窦房结综合征，称之为特发性病态窦房结综合征，其在病态窦房结综合征患者的人群中比例可高达22%～45%[1］。由此推测，病态窦房结综合征可能具有某种遗传易感性。目前临床上常通过植入永久性人工心脏起搏器来治疗病态窦房结综合征，但由于费用昂贵、电池寿命有限、囊袋感染、电极植入风险，相关的生物起搏治疗技术已成为研究热点。随着分子生物学技术特别是基因测序技术和基因文库的建立，陆续有许多与病态窦房结综合征相关的基因被发现。2014年赵允梓等[2］通过查阅大量文献提出了AKAP10、KCNJ8、Cacnald、MIR-1共4个基因可能与心律失常的发生紧密相关，并最终确定了AKAP10基因的突变与窦性停搏密切相关。2016年，Lee等[3］对韩国30例病态窦房结综合征患者通过对SCN5A基因的多态性位点检测发现了一个新的突变位点F1616Y。2017年，Ishikawa等[4］对48例病态窦房结综合征通过Meta分析确立了HCN4基因的一个新的突变位点R393H。

1 AKAP10基因的概述

蛋白激酶A锚定蛋白（A kinase anchoring proteins，AKAPs）是一组结构存在差异而功能相关的蛋白质家族，主要分布于细胞质膜、核膜和细胞器的各个部位[5］。 现已分离出数十余种AKAPs亚型，分子量为15～420 kDa。它们具有以下几方面的功能：（1）锚定功能。AKAPs蛋白含有高度保守的蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）结合域，其存在的α-螺旋结构以其疏水表面与PKA的N末端D/D结构域形成AKAP-PKA复合物，通过促进底物磷酸化水平增强细胞的信号转导。（2）定向功能。当 AKAPs与PKA联结后， AKAP的一组特殊结构，将与PKA调节亚基发生互相作用，其结果是将PKA靶向到特定的亚细胞部位， 有利于与其对应的底物发生化学催化反应。（3）AKAPs还具有与蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）、蛋白磷酸酶（protein phosphatases 2B，PP2B）、鱼尼丁受体（ryanodine receptor，RyR）及钙调神经磷酸酶（calcineufin，CaN）等结合位点相结合的能力，整合传导多种细胞信号[6］。 其中AKAPs蛋白家族中一个重要的成员是AKAP10其蛋白又称为D-AKAP2，AKAP10在心脏中发挥着关键作用，可调节许多依赖于PKA的底物水平磷酸化，从而调节心脏功能[7］。Łoniewska等[8］对117例足月出生儿进行跟踪研究发现，1936G （V646） AKAP10可能与成年人的基础心率有关，AKAP10的另一个单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）[Ile646Val（c.2073A＞G）rs203462］与心率相关。具有该SNP[Ile646Val（c.2073A＞G）］的患者迷走神经敏感性高，心源性猝死风险增加。

赵允梓等[2］研究提示AKAP10在不同组织中可能存在不同的转录本（缺失EX0N7和含有EX0N7），而心肌组织中目前仅发现一种转录本（含有EX0N7），存在（c.2073A＞G）突变的AKAP10，可能会导致心肌中AKAP10缺失EX0N7，从而导致发生病态窦房结综合征。AKAP10另一个新的突变C.682—687delAGAACT （p.Arg228_Thr229del）位于编码区EX0N4， 它的突变将会导致AKAP10两个氨基酸的缺失，而缺失的部位正好对应于AKAP10蛋白上的主要负责调节AKAP10与PKA的结合能力的RGSA结构域，因此推测，AKAP10新的突变型P.Arg228_Thr229del可能会导致AKAP10与PKA的结合异常， 进而影响PKA亚细胞定位，最终将形成病态窦房结综合征。Ishikawa等[4］通过功能实验证实位于D2AKAP2外显子14A-G的SNP，此突变造成了646位的异亮氨酸（Ile）被缬氨酸（Val）替代（I646V），而此转变正好位于D2AKAP2的PKA结合域，而Val变异体与RIa结合力比Ile约强3倍，此种转变将会造成RIa在亚细胞的定位发生异常。关联分析证实该SNP与窦性停搏显著相关，提示I646V可能通过影响PKA的亚细胞定位，进而造成相应蛋白的磷酸化发生改变，从而导致窦性停搏的发生[4］。

2 HCN4基因的概述

2.1 HCN4基因在窦房结中的分布

在心脏中关于HCNS的研究发现，HCN1、HCN2和HCN4均有其表达，但在窦房结中却以HCN4表达为主。滕林等[9］分别检测了HCN1～HCN4亚型蛋白和mRNA在兔窦房结中的分布及表达水平，发现仅有HCN4在原代兔窦房结细胞中广泛分布和表达。Chandler等[10］利用聚合酶链反应联合原位杂交和免疫荧光染色法研究HCN4mRNA在人心脏中各个部位的表达，发现在窦房结中HCN4mRNA相对于心脏的其他部位有更高的表达。萧永福等[11］应用实时定量反转录-聚合酶链反应法同样也证明了HCN4是人窦房结组织中HCNS的主要亚型（HCN4占75%）。

2.2 HCN4基因及其编码通道的结构

HCN4基因其分子量为129.1 kDa，总长5065 bp，其基因位于15号染色体短臂的23至24位基座上，可以表达1203个氨基酸多肽[12］。该蛋白的结构含有6个跨膜区，分别是S1～S6。其中S1～S2决定着各个亚型的激活曲线，S3～S4的连接区域决定着相关通道的开放[13-14］。S5～S6的区域（P区）含有一种甘氨酸-酪氨酸-甘氨酸（GYG）模体特征性序列，其对钾离子有通透性，其蛋白的羧基端包含可与环腺苷酸（cAMP）结合而调控通道电压依赖性的 cAMP结合域。因而，其既有cAMP门控特征又有电压门控特征[15］。

2.3 HCN4基因的电生理特性

在正常情况下，具有自律性的窦房结细胞起搏心脏，当上一动作电位结束时，窦房结细胞呈现逐渐自动除极， 当达到阈电位时，则激发下一个动作电位的形成，周而复始，从而形成连续的自发性活动。研究表明，HCN4基因作用是在一定频率上维持起搏，并且可随着机体不同的生理状态而发生适应性的调整[16］。Jou等[17］研究表明编码If电流的HCN4基因能够增加窦房结舒张期内向电流，从而在窦房结起搏机制中发挥重要作用。

2.4 HCN4基因与心脏起搏的关系

李继文等[18］在导入HCN4基因细胞中，用膜片钳技术探测到了起搏离子流If。证明了HCN4基因可以表达起搏离子流If。同样，仝识非等[19］关于HCN4基因表达及其生理功能的研究，发现在导入mHCN4基因的大鼠干细胞中，可以诱导出具有生理功能的心脏起搏样细胞，并在该细胞中检测到与人心脏功能相似的起搏离子流If，同样也说明了HCN4与心脏的起搏密切相关。

2.5 HCN4基因与病态窦房结综合征的关系

研究表明HCN4通道依赖于细胞膜的超级化激活[20］。滕林等[9］通过观察HCN蛋白特异性抑制药伊伐布雷定在心脏窦房结细胞电活动中的作用，发现它可以持续地抑制窦房结细胞的If电流，并最终延缓窦房结的自发起搏。Mesirca等[21］在敲除HCN4基因的小鼠中发现，HCN4通道的If电流持续减少，较正常小鼠减少70%，并随之出现心动过缓、房室传导阻滞，最终因心搏骤停而死亡。Alig等[22］将人源化的HCN4基因导入小鼠中，进而来研究cAMP调控的HCN4通道的电生理特性，结果提示，人HCN4基因突变可导致其编码的If离子流对cAMP的敏感性减弱，进而导致具有起搏功能的窦房结细胞4期自动去极化受阻，心率变慢最终导致病态窦房结的形成。Liu等[23］通过观察益气通阳对缺血再灌注的小鼠中窦房结细胞的电活动，发现其可显著上调HCN4蛋白表达和PKA的活性，从而增加心率和改善病态窦房结综合征的情况。Ueda等[24］对1例确诊为病态窦房结综合征的女性患者进行基因筛查，发现其体内的HCN4基因的第5个外显子一个G2A发生了转变， 其结果导致了一个位于核跨膜区域和cAMP的连接区域中的保守残基asp5532 asn（D553 N）发生替换。该例患者病态窦房结综合征的发生可能是由于HCN4基因的突变，导致HCN4与cAMP的连接受阻，进而HCN4在膜上的表达受阻，导致If离子流减弱，引发病态窦房结综合征的形成。Jou等[17］通过对斑马鱼的研究，发现了p.p174S、p.A480R、p.A485V、p.D553N与心脏节律和停跳密切相关。

3 SCN5A基因的概述及其电生理特性

SCN5A基因含有28个外显子，可编码2016个氨基酸的蛋白，分子量为227 kDa，其基因座位在人类3号染色体的短臂上21位基座上，可表达心脏Na+通道，该Na+通道由α亚单位和附属β亚单位组成[25］。电压门控Na+通道是一种跨膜蛋白，它可以产生快速的内向Na+电流，调控心脏动作电位的除极期，由SCN5A基因突变所造成的一系列疾病，称之为Na+通道疾病[17］。

SCN5A基因与病态窦房结综合征：SCN5A基因和多种形式的心律失常有关，包括长QT 综合征、 Brugada综合征、进行性的心脏传导缺陷、心房颤动、扩张型心肌病及重叠综合征。Lee等[3］对韩国30例病态窦房结综合征（最长的窦性停搏超过3.0 s）进行基因测序后发现7种已报道过的基因突变（G87A-A29A、IVS9-3C＞A、A1673G-H558R、G3823A-D1275N、T5457C-D1819D、T5963G-L1988R及C5129T-S1710L）和2种未报道过的基因突变 （A3075T-E1025D及T4847A-F1616Y），并对转染T4847A-F1616Y突变基因的人胚肾上皮细胞（HEK）通过膜片钳技术发现INa电流的峰值较正常未转染组增加140%，进一步研究发现F1616基因编码的Na+通道其激活和失活的电压依赖曲线发生明显的左移，结构分析证实，F1616Y在1616位点得到很好的暴露，苯丙氨酸和酪氨酸的变化未引起明显的空间位阻或螺旋堆积，不会引起显著的结构变化，考虑其发病机制其可能影响了蛋白质-蛋白质相互作用，从而导致严重的病理性后果。Jurkat-Rott等[26］对F1616Y基因突变的Na+通道的研究发现Na+通道的电压依赖曲线发生左移，增加失活Na+通道的数目，从而加速病态窦房结综合征的形成，在对S1710L的模型研究中发现，在该模型中，S1710L可以影响Nav1.5分子从6α螺旋结构到第6循环结构变化，进一步影响Nav1.5蛋白发生错误的折叠，从而影响该细胞的电生理活动，进而引发病态窦房结综合征的形成。Gui等[27］在对突变的G3823A-D1275N的Na+通道的研究中发现，其突变为杂合子突变，导致了其表达在细胞表面的定位受损，从而导致整个细胞的电流减弱。Makita等[28］在研究SCN5A突变基因L212P时发现持续性的INa电流增加，考虑其机制为突变基因可使Na+通道在激活状态下膜电位向超极化方向移动，并且减弱活化阈电位的数值，从而延缓了从失活中恢复Na+通道的可用性和减慢心房冲动传导，引发病态窦房结综合征的形成。有研究发现，当T187I突变时，Na+通道中未发现膜电流。当E161K发生突变时，其通道中的Na+电流仅为正常情况的30%[29-30］。当L212P突变时，其Nav1.5通道的动力学发生明显的变化，即该基因突变表达的Na+通道中，其稳态激活和失活曲线均将发生明显左移[29-30］。上述的改变将导致Na+通道不能维持正常的生理功能，从而加速病态窦房结综合征的形成。当Na+通道的电流强度仅为正常的1/10时，其窦房结0期上升最大幅度和传导速度均较前减弱。并且，如果Na+通道内电流的强度进一步减弱，甚至可发生完全性传导阻滞，最终参与病态窦房结综合征的发生和发展。

4 病态窦房结综合征相关基因的早期筛查和生物起搏治疗技术

4.1 病态窦房结综合征相关基因的早期筛查

目前关于遗传基因的研究方法包括：针对家系的连锁分析，针对病例组和对照组人群的关联分析。鉴于家系的血样较难采集，限制了其使用，所以目前遗传关联分析作为科研工作者发现致病基因的一种广泛使用的方法，通过染色体上固定位置的多态性遗传标记进行基因分型，发现病例组和对照组等位基因频率是否存在差异来评价某种基因变异与疾病的相对独立性分析。目前最为常用的遗传分子标记为SNP，分析SNP与疾病的关联，并依据遗传位点之间连锁不平衡原理来定位和发现潜在的致病位点。但前提是在进行关联分析候选基因的选择时，需要对候选基因生物学功能和疾病病理生理机制具有一定认知[2］。

4.2 病态窦房结综合征生物起搏治疗技术

随着分子生物学的发展，心脏生物起搏成为近来研究热点。生物起搏是指依据细胞分子生物学及其相关技术对受损的自律性节律点或特殊传导系统的细胞进行修复或替代，使心脏起搏和传导功能得以恢复。生物起搏消除了植入心脏起搏器带来的一些弊端，同时又具有正常起搏细胞的生理功能。目前研究主要涉及以下3个方面：细胞生物起搏，基因生物起搏，基因工程干细胞生物起搏[31］。

4.2.1细胞生物起搏 干细胞是一类具有自我更新能力的多潜能细胞，根据来源不同分为胚胎干细胞（embryonie stem cell，ESC）和成体干细胞。干细胞生物起搏即诱导干细胞分化为具有起搏和传导功能的细胞，并移植到患者的心脏内重新建立心脏的起搏和传导功能[32］。2001年，Kehat等[33］通过电镜和RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链反应（PCR）相结合的技术（RT-PCR）技术观察ESC衍生细胞，发现人ESC衍生的细胞具有与人心肌细胞相类似的电生理现象，可对异丙肾上腺素和拟胆碱药物产生反应。He等[34］通过在ESC来源的胚胎样胚体的自发收缩区不同部位插入微电极，检测出3种主要类型的动作电位（AP）：似窦房结细胞的AP，似胚胎心房肌细胞的AP，似胚胎心室肌细胞的AP。其中似窦房结细胞的AP有明显的4期自动去极化，具有缓慢上升支和较小动作电位幅度。 Barbuti等[35］通过膜片钳技术、免疫荧光技术以及RT-PCR技术描述了小鼠ESC分化的心脏起搏细胞的If电流的分子组成和功能特性，研究发现If通道的阻断剂伊伐布雷定，能够阻断50%的If电流，并使收缩频率下降25%，If电流的动力学研究表明在细胞分化的早期和晚期阶段都存在两种细胞，快速激活的If电流和缓慢激活的If电流，并且两者都有显著的动作电位曲线，通过免疫荧光方法表明，分化的起搏细胞表达HCN1和HCN4分化的自律细胞，对β肾上腺素能受体激动剂和胆碱能受体拮抗剂均可作出相应的反应。上述研究显示小鼠ESC来源的起搏细胞具有表达产生和控制心脏节律的蛋白，进一步说明了ESC细胞可以作为制造生物起搏器细胞来源的潜能。

4.2.2基因生物起搏 关于基因生物起搏的研究主要涉及以下3方面：（1）通过转染克隆的β2肾上腺素受体基因，使心肌细胞膜上的β2受体表达上调，增加心脏对内源及外源性肾上腺素的反应，提高心率；（2）利用基因工程的方法将编码内向整流电流IKI的Kir2.1基因发生突变，而使IKI通道成为显性失活的突变体，从而减少超极化电流，诱导心室肌细胞产生起搏活动；（3）转染编码内源性起搏电流的超极化激活的环核苷酸门控离子通道（HCN）基因，以诱导心室肌细胞产生自主反应的起搏功能[36］。

4.2.3基因工程干细胞生物起搏 Potapova等[37］将mHCN2互补DNA整合到PIRES2-EGFP的质粒载体，通过电穿孔技术转染到间充质干细胞，通过膜片钳显示转染mHCN2+EGFP间充质干细胞存在高水平的Cs+敏感电流，在电舒张期当膜电位到达（37.5±1.0）mV的情况下被激活，超极化到160 mV其表达时间依赖性内向电流的最大激活，接着去极化到20 mV。由此发现其可表达像心脏起搏电流If一样的电流，有去极化的电活动。Rosen等[38］将转染mHCN2+EGFP的间充质干细胞悬液注射入混血狗左心室前壁，4～10 d后，用标准方法刺激狗迷走神经抑制其窦房结心律，诱导窦性静止产生。结果表明，在注射转染mHCN2+EGFP间充质干细胞的5只狗的心脏中，心律起源于左心室某一固定的位点，而此位点正好对应于接受细胞注射点，进一步观察其心率为（61±5）次/min，与对照组逸搏心律的心率（45±l）次/min相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。由上述实验可推测成人mHCN2+EGFP移植构建心脏生物起搏器可以产生稳定的搏动心律，是较理想的移植细胞。

5 结语

随着人们对健康的愈加重视，医疗技术的飞速发展，越来越多的病态窦房结综合征被临床所认知。由于病态窦房结综合征严重影响人的生命健康，故人们对其病因及防治的渴望愈加强烈。随着基因测序技术的发展，对病态窦房结综合征基因层面上的认识变成可能。相信，上述这些研究将会对临床病态窦房结综合征的诊治提供一定的理论依据。