流行性感冒与流感疫苗的应用

流行性感冒简称流感（Influenza），是由甲型（A型）、乙型（B型）或丙型（C型）流感病毒引起的急性经呼吸道传播的传染病，其中甲型流感常造成世界范围内大流行；乙型流感可引起地区局部流行；丙型流感主要感染婴幼儿，一般为散在分布。人并非流感病毒的唯一宿主，猪、禽等可携带特定类型的流感病毒，但在一般情况下，流感病毒具有比较严格的宿主特异性，即仅发生人传人，但近年也有偶发的高致病性禽流感发生禽传人的事件。

流感的临床特征是潜伏期约为1～3天，以突发高热、咳嗽（通常为干咳）、咽痛、流涕、头痛、肌肉与关节痛以及严重的全身不适（乏力）为主要症状，少数患者表现为以胃肠道症状（如恶心、呕吐、腹痛、腹泻等）伴发热。流感症状可持续2周或2周以上，大多数人可在1周左右自行好转与康复，无须特异性治疗，临床上常给予退热补液等对症治疗。但在个别情况下流感可在高危人群中造成严重的并发症甚至导致死亡，如伴有心脑血管、慢性呼吸系统、消化系统疾病等基础疾病的老年人与体弱的婴幼儿。老年患者发热表现常不典型，仅以食欲减退、乏力、昏厥为表现，婴幼儿可出现高热惊厥与败血症样综合征，偶见肺炎、心肌炎、心包炎、肾功能障碍、肌病、脑病等。WHO根据相关调查估计，在世界范围内流感的年度流行可导致5%～10%的成年人与20%～30%的儿童发病，并可造成300万～500万重症病例以及29万～65万患者死亡。

预防流感的最有效方法是接种疫苗，流感疫苗应用至今已有近80年的历史。自16世纪起就有类似流感流行的记载，直到19世纪三十年代分离出了甲型和乙型流感病毒，才开始了流感疫苗的研究与应用。1945年美国第一个商用全病毒灭活流感疫苗首先在军队与学校中进行了试验。通过不断改进培养基质、灭活与纯化方法使得短时间内大批量生产稳定的、安全的、有效的流感疫苗成为可能。至20世纪70年代裂解疫苗成为主流，通过添加裂解剂溶解病毒脂膜使疫苗保留免疫原性但降低反应原性，通过纯化步骤进一步减少病毒蛋白即亚单位疫苗或纯化表面抗原疫苗。目前流感疫苗还有在研的采用重组DNA技术制备的HA和NA疫苗与鼻内用冷适应减毒活疫苗。

流感病毒基因组是由多节段负链RNA构成的，由于流感病毒复制酶的低保守特性导致病毒容易发生抗原漂移，基因组分节段特性使不同流感病毒之间易重配发生抗原转换，因此以往感染产生的抗体不能有效地防止新毒株感染，导致病毒流行。当前世界范围内主要流行的是甲1（H1）型、甲3（H3）型和乙型三种流感病毒。流感疫苗的生产用毒株一般由WHO根据全球流感监测网络得到的病毒流行情况，于每年2月公布北半球的生产用毒株，9月公布南半球的生产用毒株。若毒株的生长特性差则须由WHO的参比实验室采用重配（reassortant）的方式改善其生长特性以增加疫苗的产量，将流行株（供体株）与A/PR/8实验室适应株（受体株）共同感染鸡胚，以受体株HA和NA的抗血清进行筛选，获得生长迅速并含有流行株HA和NA基因的重配株，经鉴定后得到疫苗生产用毒株，发放至世界范围内各生产企业。季节性流感疫苗通常由2株甲型1株乙型病毒的流行株构成（三价）或再加一种乙型毒株（四价)，通过对流行株的预测与既往感染人群中累积的交叉抗体使得一针剂流感疫苗对人群能够产生足够的保护力。

2018年我国参考WHO对流感的指导意见，更新了《中国流感疫苗预防接种技术指南(2018-2019)》，以指导流感预防控制和疫苗应用工作。新版《指南》特别指出，国内外大量研究证实，孕妇罹患流感后发生不良妊娠进展为重症乃至死亡的风险更高，虽然国内仍缺少此类临床数据，但在参考大量国外对孕妇在孕期任何阶段接种流感疫苗的安全性数据并考虑到通过母传抗体可明确保护6月龄以内的婴儿，建议孕妇或准备在流感季节怀孕的女性可在妊娠任何阶段接种流感疫苗。除此之外，对特定慢性病患者、医务工作者、家中有6 月龄以下婴儿的家庭成员和看护人员推荐优先接种。据北京市CDC统计近几年北京市的流感监测在秋冬流感高发季节人群发病率约在7%～8%，为保证易感人群可以得到较好的免疫覆盖，北京市流感疫苗每年的政府采购量约在一百多万人份，首先为京籍老年人和在校中小学生免费接种。

图1 流感疫苗的研发与应用简史

目前全世界范围主要应用的为流感病毒裂解疫苗，疫苗生产企业每年根据WHO推荐的当季流行毒株，将各型毒株分别接种于鸡胚培养病毒，经冷胚后收获含有病毒的尿囊液后加灭活剂灭活后得到单价病毒液，再采用适当的方法纯化后加入裂解剂裂解，去除裂解剂经除菌过滤成为单价原液。目前常用的灭活剂为甲醛，纯化常采用密度梯度离心和分子筛层析，裂解剂常用的是Triton X-100，也可采用其他经批准的灭活剂或裂解剂。各型原液按照适当比例（30～36µg/ml）配制成半成品，经除菌过滤后、分装、包装即为成品。不同企业的流感疫苗均需依据《中国药典》及各企业获批的质量标准执行，各型病毒血凝素含量为配制量的80%～120%，每人份0.5 ml（3岁以上儿童及成人用）各型流感病毒株血凝素应为15µg。

目前执行的2015年版《中国药典》三部对流感全病毒灭活疫苗与流感病毒裂解疫苗的检定项目、检定标准及检验方法均有详细的规定。生产企业与各检定部门依照《中国药典》与企业的注册批件对流感疫苗的生产用毒种、单价原液、半成品和成品进行严格的质量控制，以确保疫苗的安全性、有效性。

毒种的质量控制为三级毒种库管理，用于生产的流感毒种须保证其减毒特性，质控要点是传代的限制性与安全性检定。主代和工作代毒种必须进行血凝滴度和病毒滴定检测，血凝滴度应不低于1:160，病毒滴度应不低于6.5 LgEID50/ml，主代毒种须进行外源性禽白血病病毒检测，主代和工作代毒种均须进行无菌和支原体检测。

单价原液的制备包括病毒收获、过滤除菌、病毒灭活、超滤浓缩、纯化、裂解和原液除菌过滤，每一环节均须进行相应的质量控制，关键点包括：①单个收获容器中的尿囊收获液均须进行微生物限度检查，沙门菌必须为阴性，血凝滴度不得低于1:160，之后可合并为单价病毒合并液进行病毒灭活；②病毒灭活的关键是，在规定的蛋白浓度范围内进行灭活后进行病毒灭活验证并检定细菌内毒素含量；③超滤浓缩的关键是，在规定的蛋白质含量范围内检定细菌内毒素含量；④纯化后须检定蛋白质含量；⑤裂解须在规定的蛋白质含量范围内进行，裂解纯化后须取样检测细菌内毒素含量并进行微生物限度检查；⑥除菌过滤后加入硫柳汞或其他规定的防腐剂即为单价原液，单价原液须进行鉴别试验、病毒灭活验证试验、血凝素含量、无菌检查、蛋白质含量；⑦半成品须检定血凝素含量、裂解剂残留量和无菌检查；⑧成品检验包括鉴别、外观、装量、渗透压摩尔浓度、pH、游离甲醛含量、硫柳汞含量、血凝素含量、蛋白质含量、卵清蛋白含量、无菌试验、异常毒性试验、细菌内毒含量以及抗生素残留量等。根据各个企业的生产特点，可对各个环节的指控要点进行合理的项目增减。

流感疫苗的检定项目中比较特殊的是血凝滴度试验、鉴别试验与血凝素含量测定。血凝滴度试验又可称为鸡血球法，是利用流感病毒可凝集鸡红细胞的特性测定毒种的血凝效价，血凝滴度效价一定程度上能体现病毒含量，可与病毒滴度试验相互补充，反映种子批中病毒的含量，《中国药典》规定毒种不低于1:160，该试验的关键在于采用敏感的1%的鸡血红细胞悬液。鉴别与血凝素含量测定采用的是单向免疫扩散法，原理是将一定量的抗血清加入琼脂糖凝胶中作为介质，血凝素抗原能与其抗血清发生特异性反应，形成肉眼可见的沉淀环。鉴别试验是采用相应（亚）型的流感病毒特异性抗血清进行单向免疫扩散试验，结果应证明抗原性与目的病毒株相一致。血凝素含量测定试验是根据在一定的范围内待测样品的沉淀环直径与抗原含量成正比，因此将标准抗原沉淀环的直径与抗原浓度进行直线回归，即可通过计算获得待测样品的血凝素含量，半成品及成品血凝素含量每1 mL各型流感病毒株血凝素的含量应为配制量的80 %～120 %，成品中每型流感病毒株血凝素应为15µg（3岁以上儿童及成人用），儿童剂型为7.5µg（6月～3岁儿童）。

鉴别试验和血凝素含量是反映疫苗的有效性指标，总蛋白含量和卵清蛋白含量是反映疫苗纯度和安全性的指标，卵清蛋白残留量也是反映疫苗的纯化程度的指标。《中国药典》规定全病毒疫苗的总蛋白含量不得超过血凝素含量的6倍。内毒素的主要来源是被细菌污染的鸡胚，也可由生产的各个环节引入，是疫苗安全性的一项重要指标。甲醛为疫苗生产中添加的灭活剂，抗生素是在种子制备阶段或接种病毒时添加的，均须严格控制其残留量。硫柳汞作为防腐剂已被证明其在疫苗中的含量对婴儿、儿童及非妊娠成人是安全的，但国内外大部分流感疫苗已不添加。

接种流感疫苗是预防流感流行的最佳途径，由于卵清蛋白残留量的严格控制，《中国药典》2015年版并未将鸡蛋过敏作为接种禁忌，美国自2016年起也建议鸡蛋过敏者可接种流感疫苗。为获得较高的接种免疫覆盖，推荐在每年10月底前完成流感疫苗的接种。因此，制定完善的流感疫苗指导原则，指导组织企业生产使国家获得充足的流感疫苗储备，不断提升流感疫苗的质量控制手段以确保快速高效的检定疫苗安全有效性已成为疫苗质量监管的重中之重。