线粒体遗传糖尿病伴耳聋的研究进展

刘怡陶 李永新

1 线粒体糖尿病伴耳聋

线粒体DNA突变是成人糖尿病的一种罕见病因，这种突变所导致的线粒体糖尿病常常合并感音神经性耳聋，又称为线粒体遗传糖尿病伴耳聋(maternally inherited diabetes and deafness，MIDD)[1]，占糖尿病的0.5%～2.8%[2]。与核基因缺陷不同的是，线粒体基因缺陷通常表现为母系遗传。线粒体遗传糖尿病伴耳聋于1992年首次被提出[3]。其诊断标准基于：①黄斑病变；②听力损失；③正常体重患者线粒体基因遗传糖尿病或空腹血糖受损。还有研究发现其中85%～98%为双侧感音神经性耳聋，最常见的突变是A3243G[4，5]。MIDD的发病年龄一般在30～40岁，由于线粒体突变具有明显的异质性，患者还会出现相应的视网膜营养不良、黄斑变性、神经受累、甲亢、肌酸激酶升高、心肌、肾脏受累等症状，首发症状多不相同，早期很难确诊[6]。

2 基因突变位点

线粒体基因突变位点很多，目前发现的导致糖尿病的线粒体基因突变约85%的患者为A3243＞G突变[7]。Jiang等[8]还发现这种突变发生在胚胎早期甚至是生殖细胞阶段，常伴随m16093T＞G突变导致线粒体DNA的从头合成。Bannwarth等[9]发现了1例在MT-ND6基因编码区存在线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)14535和14536之间胞嘧啶插入，Mezghani等[10]证实了12S rRNA中的m1555A＞G突变，这种突变是导致氨基糖苷敏感的非综合征型耳聋相关的最多的突变之一，并且发现了ND1 m3308T＞C突变。Perucca-Lostanlen等[11]构建了线粒体外线粒体细胞系，证实了线粒体tRNAGlu基因中核苷酸位置14709处的突变与MIDD相关。Tabebi 等[12]在一个突尼斯MIDD家系中发现了MT-COIII基因的m.9267G＞C和MT-COI基因的m.5913G＞A点突变。在对其家系进行进一步分析后，发现该家系成员中MT-CO2基因的m.8241 T＞G和MT-ND5基因的m.13276G＞A突变，与该家系MIDD患者的视网膜病变密切相关[13]。Adema等[6]在一个28岁糖尿病、肾病、感音神经性聋等疾病的女性患者尿液样本中，发现了MTATP6基因的m09155A＞G突变。此外，Chen等[14]发现了mtDNA G3421A的突变与MIDD相关。Janssen等[15]在一个MIDD家系中发现了位于mtDNA的D环上nt568位点，有6个碱基对插入。COII-tRNALys基因的nt8281位点上有9个重复的碱基对，且这两种长度变异均为母系遗传。

3 诊断

目前，尚无简单快速手段诊断MIDD，主要依靠家族史以及基因检测可以确诊[3]。筛查对象应包括：①有母系遗传家族史的糖尿病患者。②伴神经性耳聋的糖尿病患者，或糖尿病患者的家族中存在1个或以上非创伤性及老年性耳聋者。③糖尿病患者本身或家族成员伴中枢神经系统、骨骼肌病表现及心肌病、视网膜色素变性、视神经萎缩、眼外肌麻痹及乳酸性酸中毒等[16]。检出突变的患者，应追踪并分析其家系，对所有一级家庭成员（包括父母配偶及子女）进行筛查，并提供遗传咨询[17]。

关于基因检测，线粒体耳聋的突变形式主要有线粒体DNA大片段重排、缺失和点突变。RT-PCR主要检测线粒体缺失突变，而线粒体点突变分布在整个线粒体基因组中，超过67%的突变位于tRNA中，其次在rRNA基因中。对于已知的致病性点突变的检测方式主要有PCR-RFLP技术和ARMS-qPCR，并且可以计算出线粒体点突变野生型DNA和突变型DNA的比例[18]。

样本可选择肌肉组织及外周血测量mtDNA水平[7]。由于该疾病异质性高，不同受累的组织mtDNA水平不同，随着年龄的增长，mtDNA水平会下降[2]。有研究发现，尿液检测mtDNA水平可作为检测的首选样本[19]。

4 治疗

4.1 药物治疗

包括治疗糖尿病的药物以及缓解并发症的药物。由于突变的线粒体释放了更多的自由基，辅酶Q10(CoQ10)对于治疗有益，CoQ10是线粒体呼吸链中的电子载体，可以保护线粒体膜蛋白不受自由基的侵害[20]。HMGCoA还原酶抑制剂可以通过甲戊酸钠途径降低胆固醇水平。维生素B、维生素K、维生素C等线粒体辅助因子可以提高ATP合成能力[21]。

4.2 基因治疗

目前基因治疗的策略是使异质体发生转移，减少突变体与野生型基因组的比例，又称“基因转移”[22]。导入特定的限制性内切酶作为“特效药”来选择性地破坏突变的mtDNA。这种方法已被证明是成功的，Bafaluy等使用了含有两种多态mtDNA序列变体，分别为NZB和BALB的异质小鼠模型，其中只有一种(BALB)具有ApaLI位点。当用表达线粒体靶向ApaLI位点的重组病毒载体转染动物时，BALB小鼠模型的肌肉和大脑中的异源性向NZB突变发生了转移[23]。Tachibana等[24]报道了成熟的灵长类卵母细胞的线粒体基因组可以通过纺锤体染色体复合物从一个卵母细胞转移到一个有线粒体的去核卵母细胞中，能有效地替代核基因组。用线粒体替代技术重建的卵母细胞能够支持正常受精和胚胎发育，并产生健康的后代。遗传分析证实，出生的3例的细胞核DNA来自纺锤体供体，而线粒体DNA来自细胞质供体。这为预防mtDNA疾病在受影响家庭中的传播提供了一个新的可能性。

这种治疗策略有不同的逻辑实现，包括“异位表达”、和限制性内切酶的导入。异位表达是一种通过从基因“潜入”细胞核中，导入正常的突变mtDNA编码蛋白基因来减少突变蛋白的策略。这种方法已经在体外实验中被用于改善携带G11778A LHON 的Leber遗传性视神经病变突变的生化缺陷[23]。Yu等[25]通过将线粒体靶向序列与腺相关病毒(AAV)-VP2衣壳蛋白融合，实现线粒体内与遗传性视神经病变相关的ND4基因的表达，证明了将AAV直接靶向线粒体的可行性。结果表明，突变体AAV衣壳蛋白不仅定位于线粒体内，而且传递的ND4基因蛋白在细胞内也得到了翻译。处理后细胞ATP合成增加48%。本研究表明AAV介导的线粒体基因表达是可以实现的。AAV基因治疗庞贝病的临床研究是建立基因治疗线粒体病的关键的第一步。

虽然许多针对线粒体病的基因转移研究尚处于概念验证阶段，但迄今为止的数据表明，基因治疗有望成为一种有效的治疗方式。对于产前诊断tRNA点突变，实际上是不可能的。因为羊膜细胞或绒毛的突变负荷不一定与胎儿其他组织的突变负荷相对应。由于有丝分裂的存在，产前样本测量的突变负荷可能在出生后发生变化。所以对于家族内有MIDD患者的孕妇来说，产前诊断只是一个选择[23]。

5 MIDD与感音神经性耳聋

5.1 发病机制

目前对于线粒体疾病的听力学诊断及治疗越来越多，据报道42%的线粒体突变患者临床表现出双侧感音神经性耳聋。目前主要与听力损失相关的线粒体疾病包括线粒体脑肌病伴高乳酸血症和卒中样发作(mitochondrial encephalomyopthy with lactic acidemia and strokelike episodes，MELAS)、MIDD、Kearns-Sayre综合征(线粒体脑肌病)、进行性眼外肌麻痹(chronic progressive external ophthalmoplegia，CEPO)[26]。

Yamasoba等[27]推测MIDD的听力损失原因可能是由于突变导致了受损mtDNA的比例超过线粒体蛋白合成和耗氧量不足的表达阈值后，ATP水平下降可能导致耳蜗细胞死亡。这主要是由于耳蜗的外毛细胞有很高的ATP需求，且不能自身分裂，尤其是那些位于耳蜗底转的细胞，它们的新陈代谢最活跃。人类耳蜗的底转与高频听力有关，它更容易受到耳毒性药物、退行性变和病毒性迷路炎的损害。毛细胞依赖于血管纹提供的正常耳蜗内电位，血管纹本身具有高度的代谢活性，并有丰富的Na，K-ATP泵。假设线粒体氧化磷酸化功能障碍使ATP水平下降，从而使外毛细胞和血管纹层离子进行性失衡，导致细胞损伤和死亡。这主要与MIDD疾病本身累及高代谢器官的特点有关。由此可见，由于缺乏修复机制，随着年龄的增长，氧化磷酸化减少在mtDNA突变的患者中可能较早达到较低水平，导致进展性听力损失[28]。

在线粒体疾病导致的听力损失颞骨病理模型中，源自Corti器和囊斑的骨螺旋板神经纤维严重退化，伴有Corti器和螺旋神经节细胞的变性[29]。其中对于12S rRNA中的m1555A＞G突变，在某些人群中可能是导致听力障碍的原因。突变携带者对氨基糖苷类药物的耳毒性异常敏感，即使在正常的药物水平，也会导致听力下降。此外，即使没有氨基糖苷的接触，此类携带者也会发展成听力障碍[30]。

5.2 MIDD听力损失的表现

Hendrickx等[31]随访了6例MIDD患者，发现其中1名患者表现了相对正常的听力，其余患者听力损失出现在27～79岁不等，所有患者听力损失平均每年增加1.7 dB，500～2000 Hz频率范围平均每年损失增加2 dB，在4000 Hz处增长为2.4 dB。前庭功能和听性脑干反应检查结果正常，言语识别率尚可。其听力损失程度已经超过老年性耳聋，其中也表现出高频听力损失更严重，并且听力损失在异质性较高的患者中发病年龄更低[27]。MIDD患者两耳的听力损失程度通常是对称的[32]。感音神经性耳聋与线粒体代谢缺陷相关，起源于耳蜗基底。然而，有的听力损失严重患者还伴有蜗后病变的迹象，包括言语识别率下降、听觉反射阈值增加、ABR电位和潜伏期紊乱[33]。推测可能是线粒体疾病在影响听神经及其中枢连接之前影响更敏感的耳蜗，当病情发展到晚期时，其他的并发症多于耳蜗的退化凋亡。

5.3 MIDD患者的听力重建

听力损失只是MIDD患者多系统疾病的一部分，50%的病人会出现不同程度的听力损失，性别、发病年龄无明显相关性线粒体功能的障碍导致了内耳功能的紊乱以及听神经的受损，所以目前主要的治疗手段为人工耳蜗植入。

第一例接受人工耳蜗植入的线粒体疾病患者是Kearns-Sayre综合征患者。对于线粒体基因突变的感音神经性耳聋患者来说，因为往往不合并内耳畸形以及听神经发育不良，多数为成人语后聋，所以人工耳蜗术后效果较好。Scarpelli等[34]回顾了12例植入人工耳蜗的线粒体感音神经性耳聋患者的术后效果。12例均为重度感音神经性耳聋。耳聋的发病年龄和手术年龄各不相同，但58%的患者在手术后能够进行电话交谈，其余患者具有良好的开放言语识别能力，没有并发症。常见的A1555G突变患者的耳蜗螺旋神经节细胞数量残余较多，其人工耳蜗效果主要取决于螺旋神经节的残余数量、听神经的完整[35]。

6 总结

近年来，对MIDD的临床表现、遗传诊断、流行和发病机制的研究改变了我们对该病的认识和治疗方法。由于mtDNA基因工程的难度，线粒体基因的突变如何影响胰岛素分泌以及听力损失的机制仍然停留在猜测中，也无明确的药物可以治疗。目前仍没有明确的证据支持对线粒体疾病进行有效的干预。进一步研究需要建立广泛的治疗方法的作用。MIDD的临床表现是异质性的，高异质性水平的患者线粒体功能缺陷更严重，因此对任何治疗的效果都是不确定的，且由于对该病认识较晚，线粒体受到长期严重损害而MIDD本身的异质性也导致了该疾病易与糖尿病并发症相混淆，从而导致确诊更加困难。

在临床中，确认伴有听力损失的糖尿病患者患有MIDD具有重要意义，这可以促使患者及其亲属及早发现、预防和治疗相关疾病，一旦发现了基因突变，应对所有1级家庭成员进行筛查，并提供遗传咨询。与MIDD相关的临床相关研究领域包括分子遗传学诊断方法的改进，对环境、遗传和表观遗传学的理解的改善，以及对治疗药物的研究。未来对于MIDD的诊断需要多学科团队的参与、对患者的仔细评估以及对并发症的预期，治疗除了传统的药物治疗、对症治疗外，更多的研究将致力于分子水平的治疗。