循环肿瘤细胞检测方式及临床应用

方超 周总光

循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）是指从实体肿瘤原发病灶或转移病灶脱落，进入循环系统并参与肿瘤疾病进展、转移、复发的肿瘤细胞亚群［1］。循环肿瘤细胞理论的提出为肿瘤的复发、转移、治疗疗效监测及预后评估等相关研究提供了新的视角［2-3］，而包括乳腺癌、前列腺癌、肺癌及结直肠癌等的前期研究结果均在一定程度对此予以了验证［4-7］。现阶段研究对于不同肿瘤类型、不同分期患者外周循环中存在的CTC的种类及数量，CTC的分子生物学特征以及其在肿瘤疾病进展中的作用机制均存在一定争议。同时受限于外周循环中肿瘤细胞数量稀少，且与血液细胞成分混杂，其检测与分离极为困难，因而如何有效的检测循环肿瘤细胞并检获高纯度的循环肿瘤细胞成分对进一步的预后分析及机制研究显得尤为重要［8-10］；本文就循环肿瘤细胞的检测及检获方式、循环肿瘤细胞现阶段的临床应用等方面进行综述。

一、基于核酸表达的CTC检测方式

该方法基于CTC具有区别于血液成分细胞的DNA或RNA表达而进行肿瘤患者血清中游离核酸的检测。Gormally等［11］于2007年报道了肿瘤患者外周血循环中游离核酸的存在，而Schwarzenbach等［12］则通过扩大样本的临床分析，进一步发现晚期前列腺癌患者具有更高的血清游离核酸水平，证实了CTC相关游离核酸与肿瘤疾病病程的相关性。但血清CTC相关核酸检测方法的弊端很明显，肿瘤原发病灶或转移病灶的微环境中的凋亡细胞、肿瘤外泌体以及循环中其他有核成分细胞所携带的核酸均会对检测结果带来显著影响［11-13］。即便后续相关报道提出先行利用各种方法排除凋亡细胞及细胞碎片等核酸的影响，对纯化后的有核细胞进行CTC相关核酸检测的方法，但操作繁琐且环境、操作等因素仍会明显影响检测结果［14］。总体而言，无论检测样本纯化与否，利用血清特异核酸水平间接进行CTC检测敏感度较低；同时该方法无法进一步分析CTC的分子生物学特性，而检测血液样本需求量较大，PCR及RT-PCR等检测方法难于控制结果偏倚等一系列问题均制约了该方法的推广应用。

二、基于细胞物理特性的CTC检测方式

通常认为CTC相较于血液成分细胞具有更大的体积、更高的密度且表面电荷分布区别于其他细胞，同时部分CTC还可能表现出不同的细胞活性以及特殊色素沉着等特性，这些差异特性逐步被认识并用于进行相应细胞的检测及筛选［15-18］。前期相关研究有报道利用细胞密度的差异通过梯度离心的方式实现包括CTC在内的单核细胞与红细胞的分离鉴别，但通过该方法分离后的CTC细胞中仍会混杂小部分的单核细胞［15］。Vona等［16］的研究利用CTC直径通常大于粒细胞的特点通过过滤平台分离循环上皮肿瘤细胞；Marrinucci等［17］后续的研究也证实了该方法的可行性；但循环上皮CTC细胞之间直径差异较大，会导致部分CTC的遗漏；同时过滤平台对CTC的剪切作用等对细胞活性的影响也限制了检测后的细胞用于进一步的研究分析［18］。各种利用CTC物理特性进行检测的方法因受各类内在及外界因素的干扰，均难以实现CTC的准确检测；但这类方法的优势在于分选成本低，时间短，无荧光抗体等的干扰，所分选后的细胞可进一步用于后续分子生物学分析和细胞功能验证。

三、基于细胞表面抗体的CTC检测方式

相关细胞膜蛋白、胞浆蛋白及胞核蛋白的发现、功能验证及应用推广为CTC的检测和分选提供了新的选择，也让检测和分选方法的敏感度和特异度得以明显的改善。目前应用最为广泛的CTC分离技术主要依赖于CTC细胞表面特异表达的抗体，即CTC所表达的某些上皮细胞表面标志，通常而言这些表面标志并不表达于普通粒细胞。这其中，上皮细胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule,EpCAM）因其表达于几乎所有上皮来源的细胞而不表达于血液成分细胞故其应用最为广泛；上皮类细胞通过与特异的EpCAM磁珠结合，再经过特定磁场的筛选，已经被用于乳腺癌、前列腺癌及结肠癌CTC的检测分离［7，19-20］。其中CellSearch体系（Veridex）是FDA批准的基于EpCAM抗体的CTC检测系统，主要通过某些特定的抗体组合与细胞质角蛋白结合后的显色来进行结果的判读；检测中将粒细胞特异的抗体CD45则作为检测的阴性筛选条件，具体而言CTC定义为EpCAM阳性而CD45阴性表达的细胞亚群，但该方法计数时会遗漏数量不小的EpCAM及CD45共阳性的细胞亚群［20-21］。CellSearch体系为现有检测技术方法中较为标准且已开始应用于部分临床试验的CTC检测方法，但该体系的弊端主要在于其敏感度较低（大约每毫升血液仅检测出1个CTC细胞），单次检测通常需要较大的血样本，且仅在肿瘤远处转移患者外周血中可实现CTC的有效检测。

Nagrath及Stott等人均报道了CTC-chip的CTC检测方法，该方法使用一约78 000个涂有抗EpCAM的抗体暗槽的硅盒，利用2～4 mL全血即能实现CTC的有效检测；具体工作原理为血液流经硅盒体系时相应微粒在流体动力学的作用下与对应的抗体相结合，所检获的细胞可进一步成像检测以及用于进一步的DNA、RNA或分子相关的检测［22-23］。改进后的CTC-chip相较于CellSearch体系可在一定程度提高检测的敏感度（平均每毫升血液可检测出50个CTC细胞）及检获的CTC细胞纯度（0.1%～50.0%），更适用于一些稀少细胞及某些特殊标本的处理；同时CTC-chip检获的细胞仍具有一定的细胞活性，在短时间内将检获的细胞予以固定及相关处理，或可实现动物活体实验及相关研究。CTC-chip技术操作具有一定难度并未成为应用推广的标准方法，但其较小标本即可实现较大细胞检获量的特点或可实现患者治疗期间疗效评价的监测。

越来越多基于细胞表面标记的CTC检测方法进行试验并加以临床运用，其中多通量流式细胞技术因其高通量的特点可进行一些极其稀少细胞的检测，而多荧光通道的运用可实现多表面抗体细胞的特异性筛选及检获［24］。同时，近年来，部分研究提出肿瘤细胞在脱落进入循环系统时会经历一定程度的上皮间质化转化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT），即CTC会在一定程度弱化上皮类标志的表达而强化间质类细胞表面标志的表达；单纯使用EpCAM作为检测筛选标志会存在一定的偏差并遗漏部分在肿瘤进展及远处转移过程中起关键作用的CTC细胞［25-26］；CD133，CD44，CD26，CD24，CD166等多种分子标记在乳腺癌、前列腺癌及结直肠癌等实体肿瘤的CTC及循环肿瘤起始细胞等的有效检测中得到了一定验证［27-30］。进一步探究并验证更加敏感及特异的表面标记，探究并推广可操作性更强的检测筛选方式则将是后期研究的重点及难点。

四、其他CTC检测方式

为检测相对稀少的CTC，部分研究者利用上皮细胞的物理及生物学特性提出了一些较为新颖的方式，比如高通量显微成像扫面系统，即利用光纤扫描技术对上皮成分或肿瘤特异抗原进行扫描显像分析［31］；激光扫描细胞计量术（laser-scanning cytometry）则结合荧光成像及前向散射进行细胞鉴定［17］；多光子活体流式细胞技术（multiphoton intravital flow cytometry）则通过注入活体动物体内的荧光标记以进行显像检测［32］；此外CTC的电负荷差异，细胞膜壁，微绒毛等均曾被不同的研究报道用于CTC的分离［9-10］。

五、CTC作为肿瘤患者预后标记物

尽管各种CTC的检测方法存在各种局限性，但一些大样本的队列研究已经开始评估CTC计数的临床意义；多数研究都倾向于选择更方便且操作性更强的免疫磁珠检测的方式，并发现乳腺癌、前列腺癌及结肠癌患者外周循环中CTC均为独立的预后相关因子［22-33］。Botteri等［34］对乳腺癌晚期患者的评估发现每7.5 mL外周循环中CTC计数大于5的患者，其无进展生存期（progression-free survival，PFS）及总体生存期（overall survival，OS）更短；同样在结直肠癌及前列腺癌患者中也发现治疗前CTC计数同预后呈负相关［34-36］。目前预后相关研究主要通过免疫磁珠法进行CTC检测计数，但也有通过RT-PCR方法检测患者外周循环中上皮相关标记的表达来分析CTC同预后的相关性；但RT-PCR方法最大的弊端在于因其并未纯化CTC表达，所以其中包括了粒细胞等血细胞的成分表达［37］。同时部分研究将CTC基线水平同患者临床病理指标进行相关性分析发现，CTC表达水平同肿瘤直径大小无明显相关性，而同包括肿瘤浸润程度，肿瘤血供等生物学特征相关［38］。

六、CTC作为肿瘤患者治疗疗效评估

通常预后研究更关心基线CTC计数高于或低于某一特定值时其同预后的相关性，而CTC计数对治疗疗效的评估则需要CTC检测方式敏感度足够高以实现整个治疗期间CTC计数变化的有效监测。Nagrath及Stott等人通过CTC-chip对CTC进行检测及监测发现肺癌、前列腺癌等患者化疗、内分泌治疗前后CTC计数会明显下降；虽然治疗导致的CTC计数值变化受患者个体之间差异的影响，但仍可作为评估肿瘤治疗疗效的参考［22，33，38］。此外 CellSearch 体系及免疫磁珠等方法亦在乳腺癌及前列腺癌转移患者治疗疗效评估中得到了一定的验证及应用［21，39］。后期研究需进一步关注治疗后CTC计数的变化是否可作为监测治疗疗效反应的早期指标，以及其是否可作为全周期治疗获益的评判指标。

总体而言，现存的各种CTC检测技术主要依赖于CTC的各种物理及生物学特性，各种方式均存在一定的优势与弊端；且在治疗疗效监测、预后评估方法得到了一定的验证及应用。随着技术的改进，特异标记物的研发及二代测序技术等的推广；希望未来的CTC检测技术能够既实现外周循环中各类肿瘤细胞的完整有效检测与高纯度分离又可避免检测方法所带来的细胞损伤，更便于后期CTC分子特征及功能特异研究的开展。