地磷莫斯的免疫抑制效果及机制的研究

王路敏，李艳萍，夏俊杰，叶岩荣*

（1.复旦大学附属中山医院厦门医院，福建 厦门 361000；

2.莆田医学院附属医院，福建 莆田 351100；3.厦门大学医学院器官移植研究所，福建 厦门 361102）

在进行同种移植后,移植抗原可刺激受体发生免疫应答反应,通过细胞免疫和体液免疫的共同作用使移植物受损的情况称为宿主抗移植物反应[1-2]。同种异体移植的排斥机制：适应性免疫系统识别供体组织上表达的不匹配的HLA等位基因产物[3]，并对排斥作用负责。发生抗体介导还是T细胞介导（CMI）的排斥,取决于移植组织的来源，如皮肤主要为CMI介导的排斥,而肾脏则为抗体额CMI共同介导。在供体与受体之间HLA不匹配的数目（移植抗原数）通常决定排斥作用的强度。

T细胞介导免疫排斥的机制[4]：在同种移植中,Th1细胞主要参与急性排斥反应，Th2细胞的活化可以导致形成移植耐受。Th1细胞分泌IL-2、TNF-β、IFN-γ等,介导细胞免疫应答、器官特异自身免疫性疾病和迟发型超敏反应，在宿主抗胞内病原感染中起重要作用。Th2细胞产生IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13等细胞因子，介导体液免疫应答、感染性和过敏性疾病[5]。

1 材料与方法

1.1 淋巴细胞转化实验

刀豆蛋白A（concanavalin A，ConA）是一种很常用的丝裂原，他可以活化T淋巴细胞从而促进T细胞的增殖，Treg（CD4+CD25+）与Teff（CD4+CD25-）的活化都会受到ConA的影响,我们利用刀豆蛋白 A 刺激反应细胞使其进行增殖,在细胞中加梯度浓度的地磷莫斯,检测细胞增殖程度,判断其是否被地磷莫斯抑制。

1.2 T细胞克隆无能实验

反应细胞的提取参照上述淋巴细胞提取过程与T细胞提取过程,刺激剂可以是供体鼠脾脏细胞,也可以是ConA,将刺激剂与反应细胞混合如混合淋巴细胞/淋巴细胞转化实验，每孔加入100 U/ml IL-2，培养72小时，用Brdu掺入法检测细胞增殖情况。

1.3 淋巴细胞、T细胞凋亡实验

1.3.1 细胞提取与处理

淋巴细胞提取如上述方法，将提取好的淋巴细胞1×106加入96孔板内,并加入梯度浓度的地磷莫斯溶液，培养72小时。

1.3.2 样品染色

淋巴细胞收集：吸取96孔板内的淋巴细胞，置于1.5 mL EP管内，加800 uL的PBS清洗。

用预冷的PBS洗涤细胞2次，每次均需300 g,4℃离心5 min。收集1～5×105 细胞。

加入100μL 1×Binding Buffer重悬细胞。

加入5 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI Staining Solution，轻轻混匀。

避光、室温反应10 min。

加入400 μL 1×Binding Buffer,混匀，样品在1小时内用流式细胞仪进行检测。

2 结果与结论

2.1 地磷莫斯(deforolimus)对淋巴细胞/T 细胞转化实验的抑制作用

（1）为了研究地磷莫斯（deforolimus）在体外对淋巴细胞增殖的影响,地磷莫斯是否对淋巴细胞的增殖有抑制作用,其抑制作用是否呈剂量依赖性等,我们提取 B6 小鼠的脾脏细胞,体外用 ConA 刺激增殖,并加入不同浓度的地磷莫斯(地磷莫斯溶解在纯酒精里,且浓度为0，0.1，0.5,1，5 μg/mL的储液,工作浓度为0，1，5，10，50 ng/mL),放入 37℃孵育箱中,培养72小时,使用Brdu掺入法检测淋巴细胞的增殖情况,结果：当地磷莫斯浓度达到1 ng/mL的时候,其抑制率有明显统计学意义（P＜0.01）,随着地磷莫斯浓度的增加，其抑制率没有显著性差异。所以，当地磷莫斯浓度达1 ng/mL时,其抑制率已达到最大。

（2）运用同样的方法，我们对地磷莫斯抑制T细胞的增殖进行研究,地磷莫斯的加入,明显抑制了T细胞的增殖,其抑制率大于60%，差异有统计学意义（P＜0.001），随着药物浓度的增加，T细胞的抑制率没有显著变化，没有统计学意义。浓度为1 ng/mL的地磷莫斯已对T细胞有显著的抑制作用。因此，在药物浓度是1 ng/mL的时候已经达到最大抑制率。

2.2 地磷莫斯对淋巴细胞凋亡的影响

在缺血再灌注、组织缺血重构、神经系统退行性病变、肿瘤的发生等疾病的病理生理机制研究中,关于凋亡机制的研究具有很大的意义,可以进一步地认识到疾病的本质,因此可以有针对性地开发针对凋亡机制的靶向药物,从而提高疗效。

我们研究地磷莫斯是否可以引起淋巴细胞的凋亡，用ConA刺激淋巴细胞培养，不同的孔内加入梯度浓度的地磷莫斯（0，1，5，10，50 ng/mL），培养72 h后取出,采用凋亡试剂盒对其进行标记，然后流式上机检测。地磷莫斯对淋巴细胞凋亡的影响。随着地磷莫斯浓度的增加，淋巴细胞的凋亡比例没有增加，其变化不具有统计学意义，因此，地磷莫斯不会引起淋巴细胞的凋亡。

2.4 地磷莫斯对T细胞克隆无能的影响

T细胞激活需要两个信号的刺激：第一信号是形成的pMHC复合物被抗原递呈细胞（APCs）递呈给T细胞；第二信号通过T细胞与APCs表面的多对免疫分子结合，形成共刺激信号。当T细胞缺乏第二信号,其接触抗原后无反应性,形成了克隆无能状态，从而产生特异性T细胞耐受。克隆无能组成外周免疫耐受的主要部分，也是避免自身免疫疾病的重要机制。APCs与共刺激分子的任何一个信号的缺乏都可以诱导T细胞的克隆无能，一些促进T细胞的细胞因子（IL-2）的缺乏也可以诱导T细胞的克隆无能。T细胞被诱导克隆无能后可以通过加入IL-2来恢复其增殖能力，因此，我们可以通过加入IL-2后其增殖能力恢复与否来判断T细胞是否是被诱导克隆无能而影响其增殖能力。提取脾脏细胞，用尼龙毛过柱，提出T细胞，用ConA刺激T细胞增殖，在不同的孔加入梯度浓度的地磷莫斯（0，0.5，1 ng/mL），浓度为0.5 ng/mL的地磷莫斯没有对T细胞的增殖没有起到抑制作用,当地磷莫斯浓度达1 ng/mL时，T细胞的增殖被抑制，而加入IL-2之后，T细胞的增殖恢复。

由此得知,克隆无能是地磷莫斯对T细胞抑制的作用机制之一。

通过本课题的研究,我们证实地磷莫斯确实有免疫抑制作用，其抑制淋巴细胞的增殖，特别是T细胞的增殖，并且通过诱导克隆无能等方法起到免疫抑制的作用，诱导细胞凋亡不是地磷莫斯起免疫抑制作用的方式。