微球体在骨组织工程中的研究进展

崔赟谦 谭宇 吴轶群

【提要】 微球体指由天然或合成的高分子材料制成的、直径从几十微米到几百微米不等的微小球体。该材料具有良好的多孔性、生物相容性、生物降解性、递载缓释功能以及成骨诱导性等优势，使其成为极具应用潜能的骨组织工程材料。在骨再生过程中，微球体可为种子细胞的黏附、增殖与分化提供微环境，维系一定的立体构型而引导组织细胞的迁移生长，并可作为干细胞、生长因子、药物等的载体，更好地调控新骨形成。本文对微球体的特征及其在骨组织工程中的研究进展进行综述，并展望该材料未来的应用发展。

微球体指利用天然或合成的高分子材料，将固体或液体药物包嵌成直径几十到几百微米的微小球体。微球体材料来源广泛，种类繁多，主要可分为天然高分子材料（如淀粉、壳聚糖等）、无机材料（如二氧化硅、羟基磷灰石等）和合成聚合物材料（如聚乳酸、聚乳酸/羟基乙酸等）。近年来，微球体已越来越多地应用于骨组织工程中。

骨组织具有再生能力，正常情况下能自我修复并持续进行生理性改建。但由于炎症、肿瘤、外伤或发育畸形等引起大面积骨缺损时则很难自愈，需借助骨移植等方法进行治疗。然而，骨移植常伴随着许多相关并发症，如移植后供骨区易出现骨折、感染、疼痛，宿主免疫反应，移植成功率低等。

微球体作为一种新型生物支架材料，具有较好的表面体积比、生物降解性、生物相容性、成骨诱导性以及递载功能等优势，使其成为极具应用潜能的骨组织工程材料。将其植入骨缺损区后，伴随着骨基质的形成和缺损区组织的重构，微球体以与组织新生相适应的速度逐步降解，最终被新生组织完全替换，实现骨再生和功能性骨的形成。在骨再生过程中，微球体可为种子细胞的黏附、增殖与分化提供微环境，维系一定的立体构型来引导血管等组织细胞的迁移生长，并可作为干细胞、生长因子、药物等的载体，更好地调控新骨形成。

本文对微球体的特征及其在骨组织工程中的应用的研究进展进行综述，并展望该材料未来的应用发展的可能性。

1 微球体的特征

1.1 微球体的直径

微球体直径从几十微米到几百微米不等，其直径受多个制备参数影响。Naito 等[1]制备的PLGA 载药微球体直径呈正态分布，主要集中在20～30 μm 范围内，平均21.07 μm。扫描电镜观察显示，微球表面形态规整均匀，近似圆形。Li 等[2]用S/O/W 乳化方法制备了β-TCP 微球，当搅拌速度为400 r/min和200 r/min 时，SEM 下可见两种微球体直径分别为250 μm和500 μm，表明搅拌速度可调整控制微球体大小。研究发现，微球体粒径大小对药物包封效率、产品注射性、药物释放率以及成骨效果有明显影响。Lin 等[3]将不同尺寸的封装了利培酮的PLGA 微球体和乙酸异丁酸蔗糖酯（SAIB）混合，研究微球体粒径对药物释放率的影响。大微球体表现出多孔的内部结构，导致了药物能更迅速地从微球体扩散到SAIB 中。因此，含有大微球的m-SAIB 在体内初始药物释放速度较快，随后逐渐减慢。小微球内部孔隙较少，初始药物释放量显著降低，4～54 d 的药物释放率略有升高。Liao 等[4]研究了PLGA微球尺寸对注射CPC/PLGA 后豚鼠胫骨模型骨形成的影响。将注射磷酸钙水泥（CPC）和PLGA 微球体两种制剂一起注射到经骨髓切除的胫骨髓腔内，发现成骨效果与PLGA 微球尺寸有关。含有小直径PLGA 微球的CPC 的骨形成总量是含有大直径PLGA 微球的CPC 的两倍。

1.2 微球体的孔隙形貌

不同于传统微球体的实心特征，多孔微球在表面有外部孔隙，或在核内有内部孔隙（外部和内部通常是互连的），活性物质可以溶解或分散在微球表面或核内。多孔结构使微球体具有如下优势：多孔结构具有大的比表面积和孔体积，药物可吸附在多孔微球的表面或进入孔道内部，通过孔结构的调整可实现药物释放速度的可控性；多孔结构致使微球密度低；孔隙率在产能效率和释放动力学方面起着重要作用。众多研究证实，孔隙的直径、数量和结构是影响多孔微球性能的关键因素。Yuan 等[5]以明胶微球制备组织工程支架，发现支架的孔径大小与明胶微球的大小直接相关，呈现出相同的大小变化趋势，且支架的孔径大小对不同细胞的黏附作用不同。Hossain 等[6]发现通过简单地选择玻璃配方和颗粒大小，可以很容易地控制微球孔隙度（与其表面积有关）。孔隙率的增加导致降解过程中质量损失的增加，并因表面积变大，使得离子释放量增多，从而控制用于潜在生物治疗离子的离子释放速率。

1.3 生物相容性

微球体与机体的生物相容性与其本身的物理性状（如体积、形状、介孔大小等）及表面化学性质（表面电荷、亲水性、表面基团种类等）密切相关。目前认为，各种类型的微球体只要以最优化的结构和合适的剂量使用于机体，则可以认为是无害的，并且可以通过表面改性赋予其更多的性能，以进一步改善材料的生物相容性，降低对机体的毒性。Chen 等[7]采用S/O/W 技术将负载牛血清白蛋白（BSA）的卵磷脂纳米颗粒，通过卵磷脂囊泡的初始自组装和随后的脂质转化获得，然后封装到PLGA 基质中形成复合微球。PLGA 复合微球比传统的水包油（W/O/W）双乳液法制备的聚乳酸（PLGA）微球具有更好的生物相容性，且无明显的细胞毒性。Hsu 等[8]在PMMA微球表面制备了一层薄的磷灰石，发现细胞活力比对照组有所增强，说明磷灰石层提高了微球对成骨细胞的相容性。

1.4 缓释作用

因微球体性质稳定，生物相容性好，故可作为载体负载各种药物，以实现药物输送功能，缓慢释放药物，释药结束后载体在体内经生物降解自行消除，这对生物活性易丢失的多肽及蛋白类药物具有很好的实用价值。1974 年，Kramer 等[9]制备了白蛋白微球体，负载巯基嘌呤后可在体外有效释放。微球体作为良好的缓释系统可避免药物在体内被组织液迅速稀释和代谢，或因酶的作用而失活，使药物集中在靶组织附近定位释放，提高治疗效果。Zhang 等[10]将一线抗HBV 药物恩替卡韦（ETV）包封进PLGA 微球，研发出持续缓释的治疗乙肝的药物输送系统，从而避免乙肝患者因间断使用抗HBV 药物而病情加重，减少病毒反弹的机会和给药的频率，也可减轻每天空腹服用ETV 而导致的恶心、呕吐、腹痛等不良反应，提高患者的依从性，改善治疗效果。此外，通过缓释系统还可延长药物在体内的作用时间，更好地促进细胞增殖、分化和组织再生。Qutachi 等[11]制备了一种可降解的PLGA微球，可在7 d 内以局部有效浓度持续释放VEGF，实现生理血管生成，避免因VEGF 的过度释放而造成血管渗漏，适用于缺血性组织或伤口的治疗。

为避免患者产生不良反应，作为载体的微球应有效控制药物突释效应，使药物平稳、缓慢释放。微球体内部的药物释放取决于微球体结构的侵蚀和破坏作用，故可通过改变微球体材料的表面离子特性或材料聚合物的结构来改变药物缓释曲线。Khan 等[12]采用交联法制备白蛋白微球，将微球的表面性质由亲水性变为疏水性，从而改变药物的释放。交联度越高，白蛋白的溶解度越低，药物从微球中的释放越慢。Lei等[13]通过制备包裹生长因子的PLLA-PLGA 双层核壳式微球来研究微球体中影响蛋白释放的参数。研究结果表明，外壳中的蛋白质首先释放，再是核中的蛋白质被释放。此外，通过改变封装材料的比例，可以调整核心和外壳中生长因子的释放速率。

1.5 生物降解性

伴随着骨基质的形成和缺损区组织的重构，微球体以与组织新生相适应的速度逐步降解，最终新生组织完全置换支架材料，实现骨再生和功能性骨的形成。Wei 等[14]在裸鼠背部皮下注射载hBMSC 的PLGA/5SL/BMP-2 和PLGA/BMP-2 微球，进行体内异位骨形成试验。HE 染色、Masson 三色染色和OCN 染色显示，第1 周未观察到PLGA 基微球的明显形态变化；第8 周，部分PLGA 基微球出现畸形，部分间隙出现在PLGA 基微球中。提示PLGA 微球在体内异位骨形成过程中缓慢降解。Wei 等[15]制备了聚羟基脂肪酸酯中空多孔微球（PHA OPMs），皮下注射入小鼠体内，6 个月后，HE 染色发现PHA OPMs 降解成不规则形状，PHA 降解主要释放3-羟基丁酸，可促进周围组织的生长。研究显示，可通过调整蛋白酶的浓度控制微球的降解速度。Annamalai 等[16]制备了明胶微球，使用不同浓度的胶原酶在37 ℃下降解微球，发现微球的降解呈现剂量依赖性。在低胶原酶浓度（1.0 g/mL）下，微球的降解可忽略不计（观察时间超过48 h）。在高胶原浓度（7.5 mg/mL和10 mg/mL）下，微球降解速度非常快，随后达到稳定状态。当胶原酶浓度为5.0 mg/mL 时，微球降解稳定且持续时间超过48 h。

1.6 抗感染特征

植骨区感染是造成植骨失败的重要原因。研究显示可通过在微球体中添加各类抗炎症成分来增强微球体的抗感染性能。小檗碱（Bbr）是一种水溶性异喹啉生物碱，具有抗真菌、抗炎、抗菌等生物药理作用。Cai 等[17]将CMCSM、Bbr/CMCSM 微球体分别和金黄色葡萄球菌培养24 h，通过观察材料周围药物扩散而抑制细菌引起的圆环来进行评价。CMCSM 组未观察到明显的抑菌环；而Bbr/CMCSM 组培养皿中央出现抑制区，表明Bbr 有显著的抗菌活性。Wei 等[18]制备了表面负载纳米银和磷灰石的微球，研究其抗菌性能。将微球和金黄色葡萄球菌培养24 h 后，出现了明显的抑制区，展现了良好的抗菌作用，其抗菌活性主要来自微球中银离子的持续释放。后进行体内试验，制备SD 大鼠感染颅骨缺损模型（φ=8 mm）。植入微球体术后1 个月，与对照组相比，表面负载纳米银和磷灰石的微球组感染明显减轻，HE 染色显示成骨效果更好，证实了表面负载纳米银和磷灰石的微球确实能有效治疗有感染风险的骨缺损。Qiao 等[19]将PLGA 微球体包封莫西沙星，在体外能缓慢释放莫西沙星。实验证明MOXPLGA 微球具有较强的抗菌活性和抗菌生物膜抑制性能，因此新型MOX-PLGA 微球可作为治疗骨髓炎的良好载体。

2 微球体在骨组织工程中的研究及应用

微球支架在骨组织工程中的应用已引起了广泛的关注。微球体在理化性能上很好地模拟了天然的骨细胞外基质，能促进成骨过程[20]。Borden 等[21]将可生物降解PLGA 微球制备成微球支架，所制备的支架具有30%～40%的孔隙率，孔隙互连度为100%，可作为松质骨再生的模板；抗压强度范围在130～300 MPa 之间，适用于骨再生。此外，细胞实验表明，骨髓干细胞可在相邻微球体孔隙周围的同心圆间形成有张力的细胞质连接[22]。由于天然的球形结构，微球支架修复再生组织的方式与由排列在中央哈弗氏管周围、同心圆样的矿化胶原片所组成的骨小梁十分相似[20]。

在现有的方法中，生物活性玻璃与可降解聚合物的组合方式备受关注[23]。该方法能充分发挥生物玻璃的骨再生性能和可降解聚合物的球化能力。活性离子如钙、磷酸盐和硅可以从玻璃成分中释放出来，并影响细胞功能，如细胞增殖、分化和矿化[24]。因此，离子控制成骨功能被认为是使用生物活性玻璃与聚合物复合微球的一个重要优点。研究证明，磷酸钙和磷酸三钙（TCP）可以加入微球支架中，加入的陶瓷增强了与骨组织相关的细胞外基质（ECM）成分的分泌，刺激细胞向成骨细胞分化[25-26]。Bo Li 等[2]制备了可注射的β-TCP 微球，在两周的测试期间微球持续释放Ca2+，显示良好的生物降解性并提供钙来源。β-TCP 微球有效提高了BMSC 骨基因（OCN、RUNX2）的表达，证实微球可以诱导成骨细胞的分化。将联合培养的BMSC 和微球成功植入8 周龄裸鼠皮下，发现β-TCP微球可形成一个诱导成骨细胞分化和骨再生的微环境，这意味着β-TCP 微球作为骨替代材料有着潜在的应用前景，可修复形状不规则的骨缺损。

微球体不仅可以支撑缺损空间作为组织工程骨再生的框架，也能通过递载各类分子离子、生长因子及药物更好地调控新骨形成。

在微球体中掺杂锌、锶等元素，有利于促进成骨并修复骨缺损。研究表明，锶通过降低破骨细胞活性、增加破骨细胞凋亡，同时增强成骨细胞活性、减少成骨细胞凋亡来减少骨吸收[27-29]。Henriques 等[30]在Hap 微球中掺杂锶，实验发现在骨缺损模型中，含锶微球组比不含锶微球组更早地形成新骨，生成新骨的体积更多且外形愈合更良好。

通过微球体负载生长因子促进组织工程骨再生也是近年来研究的热点之一。BMP-2 是转化生长因子超家族（TGFβ）的成员，对骨形成有刺激作用。然而，尽管BMP-2 具有很强的骨诱导活性，但由于缺乏合适的递送系统，其临床应用受到限制[31]。Lee 等[32]制备了负载BMP-2 的PLGA 微球体，并将其制作成3D 支架，研究成骨效果。将负载BMP-2 的支架和未负载BMP-2 的支架分别与MC3T3-E1 共培养，发现负载BMP-2 支架组中骨组织相关基因ALP、OCN 以及COL-1的表达均更高。同时，体内实验发现，负载BMP-2 支架相比对照组可提供更好的骨再生环境，大鼠颅骨骨缺损区域减小，骨形成区迅速增加。Zhang 等[33]将BMP-2 模拟肽P24 负载至PLLA 基微球，并与兔BMSC 混合，皮下注射至裸鼠体内。同空白对照的PLLA 基微球相比，偶联P24 的PLLA 基微球具有生物学功能，在诱导兔BMSC 成骨分化及异位骨形成方面有良好的成骨特性。

糖皮质激素对于诱导成骨细胞分化和形成矿化细胞外基质有着重要的影响。Dawes 等[34]制备了载地塞米松PLGA微球，分别以不同浓度与SV-HFO 细胞共培养，经过7 d 的孵育，ALP 活性表达强烈，茜素红染色发现基质矿化随微球浓度的增加而增加，证实了负载地塞米松的PLGA 微球通过地塞米松的持续释放诱导成骨细胞分化。辛伐他汀具有成骨和成血管活性，Yu 等[35]研究了负载辛伐他汀的介孔羟基磷灰石（S-MHMs）对大鼠BMSC 成骨分化及新生血管生成的影响。结果表明，S-MHMs 能同时促进骨再生和新生血管形成，在骨缺损修复方面具有巨大的潜力。Li 等[36]的研究表明，负载姜黄素PLGA 微球可以通过减轻线粒体功能障碍，调节Keap1/Nrf2/HO-1 信号通路，抑制糖尿病诱导的活性氧生成。因此，糖尿病对BMSC 增殖、迁移和成骨分化的负面影响也明显减轻。将负载姜黄素PLGA 微球植入2 型糖尿病大鼠骨缺损，与单纯支架植入相比，前者显示出更强的成骨能力。

骨再生治疗方法的成功与否取决于支架内血管的浸润程度[37]。为进一步验证微球体在骨再生方面的潜力，Jabbarzadeh等[38-39]证实内皮细胞在微球支架上表现出正常的形态、结构和功能表型，说明微球体植入体内时能支持血管的形成，促进周围组织的血管浸润。Boldbaatar 等[40]制备了掺钴的硅酸盐微球，可持续释放双离子（硅酸盐和钴），被证明可协同上调血管生成的关键基因，如HIF1 -α、VEGF 及KDR 等。离子的掺入促进了内皮细胞的极化、迁移、归巢和新生血管的生成。

3 小结

微球体具有良好的多孔性、生物相容性、机械学性能、缓释功能、生物可降解性，作为骨组织工程中的新型支架材料，为修复骨缺损提供了新思路。与传统组织工程支架相比，微球支架有许多优势：①多孔网络；②缓释生物活性因子和药物；③可注射性及可塑性使其在微创手术中有应用潜力。但尚存一些不足，有待进一步研究解决：微球的制备过程影响因素较多，微球粒径大小、微孔的形态与孔径大小等不能精确控制；微球的载药率和包封率相对较低；制备过程中采用的致孔剂、有机溶剂等未能从产品中彻底除去等。随着研究的不断深入，新技术的不断涌现，微球体在骨组织工程中的应用将越来越广泛。