MicroRNA-29在纤维化相关疾病中的调控作用*

桂 丽 宋启琴 黄加权△

1.孝感市中医医院肝病科 (湖北 孝感， 432000) 2.华中科技大学同济医学院附属同济医院感染科 (湖北 武汉， 430030)

微小RNA(miRNA)是一类长度约19～24个核苷酸(nt)的内源性非编码小分子单链RNA,广泛存在于真核生物细胞中,通过碱基互补配对与靶基因mRNA3′UTR特异性结合,引起靶基因mRNA的降解或者抑制其翻译,从而广泛地负调控靶基因的表达[1]。miRNA除在进化过程中具有高度保守性外，大量的研究还表明，miRNA的表达在组织功能特异性和个体发育时序性方面也具有重要调节作用，即不同生物体或同一个体不同组织中miRNA表达谱不尽相同，一个miRNA在同一种生物个体的不同发育阶段也存在着表达差异。目前已有1181个前体和2588个成熟的人类miRNA在miRNAbase ver.21.0注册，并且其数量还在呈指数增长，单个miRNA可有多个mRNA靶点，而单个mRNA也可受多个miRNA的调控[2]。多项研究发现miRNA与其所调控的靶基因之间存在复杂的调控网络,如一个miRNA分子可能调控多个基因的表达,一个基因也可受多个miRNA分子的调控,而miRNA自身的表达也受多种机制的调控。在细胞内miRNA既可通过调控相关基因的表达从而调控细胞内的信号传导,同时其自身的表达也受细胞内某些信号通路的调控从而形成一个封闭的细胞内信号调控环路。miRNA被发现在正常生理中发挥调节作用，包括发育、造血过程、器官形成、先天免疫、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等，但在疾病中表现不明显[3]。近年来，越来越多的研究已证实miRNA也参与多种疾病(如癌症、心血管疾病、纤维化疾病，病毒感染)的发病及发展过程，而且其表达变化还与病变程度密切相关[4]。

纤维化是以细胞外基质成分过度沉积为特征的一种病理过程，它主要与细胞外基质成分合成及降解失衡有关[5,6]。它使器官组织结构发生改变，血液供应受到影响导致器官的功能逐渐减退甚至丧失。随着对miRNA进一步的深入认识，我们发现miRNA在纤维化疾病中起到了极其重要的作用，不仅参与纤维化的发生过程，其表达水平的变化还与纤维化程度密切相关。miR-29是新近发现的与纤维化疾病密切相关的小分子RNA家族，参与多种器官纤维化发生发展过程，包括心、肝、肾、肺纤维化、系统性硬化症等[7-13]。

1 microRNA29结构、表达及功能

miR-29家族包括miR-29a、miR-29b和miR-29c。Lagos-Quintana等[14]于2001年在人HeLa细胞中首次利用miRNA基因直接克隆策略成功克隆获得miR-29a，后来相继获得其类似物miR-29b和miR-29c。它们拥有相同的种子序列AGCACCA，仅为末尾极少数核苷酸不同：miR-29a和miR-29c均含22个核苷酸，二者仅为一个核苷酸差异，而miR-29b则含23个核苷酸。与miR29a/c不同的是，miR-29b 3′末端存在AGUGUU序列，此序列具有核定位的作用，因此miR-29b成熟序列主要位于细胞核内。由于miR-29b基因同时定位于miR-29a所在的7号和miR-29c所在的1号染色体上，故又将其分为miR-29bl和miR-29b2，多数情况下miR-29a 和miR-29bl在相同组织细胞中的表达调控与生物学功能相似；同样miR-29b2与miR-29c也具有相似的生物学行为[15]。最近研究发现，miR-29在胚胎期组织中低表达甚至不表达，而在生物体成熟组织细胞(肝脏、肾脏、肺和心脏等)中高表达,在机体成长的不同阶段miR-29表达也有不同意义[16]。Kamran等研究结果显示，miR-29表达水平在组织发育与年龄之间呈正相关，成熟组织时达到最高水平[17]。进一步研究表明，miR-29表达的时间变化可以选择性地影响对胚胎干细胞(ESC)分化至关重要的一系列基因，这表明miRNA-29是ESCs的直接调控因子[18]。如此看来，即使它们是由两个主转录体共转录而成，在某些情况下这三个成熟miR-29家族成员也可能是由不同的机制调控。对人类鼻咽癌细胞的细胞核和细胞质组分中小RNA深度测序结果发现，大多数成熟的miRNA在一定程度上均转导入核内。然而，同样清楚的是，包括miR-29b在内的几个miRNA在细胞核内表达丰富。分析结果为miR-29b在细胞核中含量是细胞质中的4.54倍。同时检测miR-29c在细胞核中含量为胞质的2.84倍。胞质和胞核中miRNA可能与不同的蛋白质相互作用并发挥不同的生物学效应，此机制尚待进一步的阐明。最近，多项研究已表明miR-29是一个与纤维化疾病密切相关的小分子RNA家族，miR-29可直接与多种胶原蛋白及金属蛋白的3′UTR结合而抑制其表达，参与多种器官组织纤维化的调控，包括肝、肺、肾、心肌纤维化及系统性硬化症等。

2 microRNA29与纤维化疾病

2.1 microRNA29与肝纤维化 肝纤维化是许多慢性肝脏疾病(如慢性肝炎病毒感染、慢性血吸虫病、酗酒、非酒精性脂肪肝和自身免疫性肝等)所致的肝内结缔组织异常增生、肝内弥漫性细胞外基质过度沉淀的病理过程。它使肝脏结构发生改变，血液供应受影响，肝脏功能逐渐减退甚至丧失，最终发展为肝硬化。肝星状细胞(HSC)的激活是肝纤维化形成的中心环节。在正常肝脏组织中，HSC处于静止状态，当肝脏损伤时，HSC受到各种致病因子的刺激，从静息状态转化为具有增生性、纤维原性和可收缩性的肌成纤维细胞后表达a-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)并产生大量的ECM在肝脏沉积，最终导致肝纤维化的发生[19]。总之，肝星状细胞的活化是肝纤维化发生的主要驱动因素，并伴随有microRNA的变化[20]。

Yong He等发现在肝内多种细胞中，miR-29b在星状细胞中表达最高，是其在肝细胞、库弗氏细胞及内皮细胞中的100多倍[21]。且研究表明，在肝纤维化小鼠和进展性肝纤维化病人肝脏组织中miR29a/b/c的表达均明显下降，且miR-29的表达随肝纤维化进展呈进行性下降，这些都与HSC的活化和细胞外基质基因的上调相关。在人肝星状细胞(LX-2)中，miR-29b可通过分别与Ⅰ型胶原蛋白3′UTR和SP1(specificity protein 1)3′UTR直接结合共同抑制I型胶原蛋白的表达。转染pre-miR-29b后,可抑制TGF-β1引起的I型胶原蛋白和mRNA的升高，而过表达miR-29b可明显抑制小鼠肝星状细胞中胶原蛋白的表达。LX-2细胞中miRNA-29a的过表达导致热休克蛋白和酪氨酸氧化酶(LOX)表达显著抑制，这对ECM的成熟至关重要。因此，miRNA-29a被认为参与调控ECM和纤维形成后的转录过程[22]。研究者们还发现，与健康人相比肝病患者血清中miR-29a水平明显下降，且其下降程度与肝硬化严重程度呈正相关，Child分级为B和C的肝硬化患者miR-29a水平比A级患者更低。Nicholas等[23]利用胆管结扎方法诱导的实验性肝纤维化模型中，miR-29a/b1表达上调，然后使用反义寡核苷酸体内抑制其表达，证实了IGF1和Il1RAP为miR-29的潜在靶点。我们已经用序列分析技术，进一步验证了IGF1和Il1RAP为miR-29的直接靶点。Matsumoto等[24]研究表明在原代HSCs中转染miR-29b前体既明显抑制胶原蛋白Ⅰα1和α2mRNA的表达，还可以降低与原代HSCs活化相关的蛋白如α-SMA,DDR2,FN1,ITGB1,及PDGFR-β mRNA的表达。在LX-2细胞转染mir-29b后3天和5天测定细胞活力分别为89%和81%，这些研究结果表明miR-29b具有抑制HSC增殖及活性作用。Toyono等[25]发现在纤维化过程中表达下调的miR-29，不仅抑制胶原蛋白的合成，而且还干预促纤维化细胞因子PDGF-C和IGF-I的信号连接。

2.2 microRNA29与肺纤维化 许多间质性肺疾病与肺纤维化有关，从而导致在肺泡壁增厚和肺瘢痕形成。各种刺激包括持续性感染，自身免疫反应、过敏性反应、化学侵蚀、辐射及组织损伤等均被认为参与慢性炎症反应的启动环节。肺纤维化是以肺泡上皮细胞损伤、基底膜(BM)的完整性破坏、再上皮化消失导致上皮-间质转化(EMT)、炎性细胞浸润、纤维母细胞增生、细胞外基质沉积以及纤维疤痕形成为特征性表现。然而，miR-29在EMT过程中参与肺纤维化的作用机制尚不清楚。肌成纤维细胞和成纤维细胞通过分泌一系列纤维化相关细胞因子以及合成过多的胶原蛋白和其他基质蛋白在肺纤维化形成病理过程中发挥重要作用。在成年小鼠肺组织中，miR-29主要表达于易发生肺纤维化的肺泡壁和胸膜下细胞以及肺泡管入口处的纤维母细胞中。体外试验也显示似乎miR-29更倾向于在间充质来源的细胞系中表达。在博来霉素诱导的肺纤维化小鼠模型中，miR-29表达显著下降，其下降水平与纤维化严重程度和纤维化靶基因的表达水平呈负相关，如COL3α1，COL4α1。体外试验也表明，miR-29在人胎肺成纤维细胞(IMR-90细胞)中明显下调，肺纤维化中TGF-β/SMAD信号负性调控miR-29，有趣的是miR-29过表达反过来可以下调TGF-β和SMAD3信号分子。然而，miR-29可以调控与TGF-β无关的纤维相关因子，包括层黏连蛋白、整合素、基质金属蛋白酶(MMP)、膜结合蛋白酶(ADAM)[17]。研究表明，miR-29在人肺成纤维细胞中可激活磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路和Wnt/β-catenin通路，从而在TGF-β1诱导的ECM合成中发挥了关键作用[26,27]。另一项研究发现，通过静脉注射miR-29b，模拟博莱霉素诱导小鼠肺纤维化模型，可以缓解博莱霉素诱导的纤维化和炎症反应，降低胶原蛋白的表达，从而阻断和逆转肺纤维化[26]。这些研究表明，miR-29在肺纤维化中具有良好的抗纤维化活性，这可能是一种潜在的治疗方法。

2.3 microRNA29与肾纤维化 肾脏纤维化是在各种致病因素(如炎症、损伤，高血压、糖尿病等)作用下肾脏组织出现肾小管上皮细胞消失，代之以大量炎症细胞浸润、肾间质成纤维细胞活化、增殖及表型转分化,促使过量ECM在肾间质积聚、正常肾脏结构改变为特征性表现的间质肾纤维化。肾小管间质纤维化各种慢性肾脏疾病进行性发展的共同通路,是导致终末期肾病的主要病理基础。

我们发现，在UUO(单侧输尿管梗阻)诱导的肾间质纤维化小鼠模型中miR-29的表达水平显著下降，且纤维化严重程度与miR-29表达水平密切相关。TGF-β刺激肾小管上皮细胞及足细胞后miR-29表达下降且各种胶原蛋白形成，而miR-29过表达可抑制TGF-β引起的上皮间充质(EMC)交联沉积,这些结果证实miR-29可能与肾脏纤维化密切相关[28]。Fang等[29]发现TGF-β1可通过刺激SMAD3与miR-29启动子结合，下调miR-29的表达。miR-29以细胞外基质为靶基因且为TGF-β/Smad3信号通路介导的纤维化下游抑制剂。Liu等[30]发现SMAD7的去除促进了肾纤维化和炎症，这是由Ang-II介导的并可能与Sp1-TGF-β/SMAD3-NF-(B信号增强和miR-29表达降低有关。因此，Smad3-miR-29轴很有可能为治疗纤维化的一个重要通路。我们发现与新生小鼠相比，在成年小鼠肾脏中miR-29的表达显著上调，其他器官中也观察到了类似的表达方式。给予3天以上高盐饮食建立Dahl盐敏感性(Dahl/SS)大鼠高血压及肾损伤模型后发现，miR-29b在SS.13BN大鼠肾髓质中表达量显著高于SS大鼠。通过静脉给予反义寡核苷酸敲除SS.13BN大鼠体内miR29以及大量体外实验结果均表明miR-29b的靶基因为多个细胞外基质基因(COL1α1，COL3α1，COL4α1，Col5a1，Col5a2，Col5a3，COL7A1 COL8A1，MMP2和Itgb1)，因此可以抑制SS.13BN大鼠肾间质纤维化的进展。

2.4 microRNA29与心脏纤维化 心肌纤维化是各种原发与继发性心脏疾病如高血压、心肌梗死及心肌病等引起的胶原蛋白等细胞外基质蛋白分泌增加和异常沉积，心肌间质网络异常重构、结构发生紊乱，是导致心律失常及心功能衰竭等严重并发症的主要原因之一。心脏成纤维细胞是心肌细胞外基质的主要来源，在各种病理状态下，心脏成纤维细胞可被TGF-β等细胞生长因子激活，发生异常增殖并分泌细胞外基质。多项研究已表明各种原因导致的心肌纤维化都伴随着一系列特定miRNAs表达变化。

Van Rooij等[31]于2008年发现miR-29a/b/c在小鼠心梗模型和心梗病人心肌梗死区及近梗死区表达明显降低，并且miR29a/b/c在心脏成纤维细胞中的表达量比心肌细胞明显降低。利用miR-29b反义寡核苷酸体内沉默miR-29b后，I型、Ⅲ型胶原蛋白、原纤蛋白及弹性蛋白及mRNA水平显著升高，促进心肌纤维化。体外转染miR-29b类似物后则明显抑制心脏纤维母细胞中胶原蛋白及其mRNA表达，从而抑制心肌纤维化。因此，这些都提示miR-29参与了心肌纤维化过程，可能是治疗心梗后心肌纤维化的靶点之一。miR-29家族的相应靶点是编码与纤维化相关的细胞外基质蛋白mRNA，包括I型胶原蛋白、III型胶原蛋白、纤维蛋白-1型(FBN-1)和弹性蛋白[32]。

研究还表明，通过抑制激活T细胞c4(NFATc4)转录因子核因子的表达，miR-29在心肌肥厚和心衰模型中的表达下降[33]。TGF-β是促进心肌纤维化的主要分子，可下调miR-29在心肌成纤维细胞中的表达。另一项研究发现，在充血性心力衰竭(CHF)相关的心房颤动(AF)犬模型中，心房miR-29表达下降。在犬心房纤维母细胞中，miR-29的降解可以显著增加I型胶原-1(COL1A1)、III型胶原(COL3A1)和FBN的胶原表达。在本研究中，Dawson等[34]也观察到CHF患者的miR-29表达降低。研究还发现，miR-29在心房纤维重塑中起着至关重要的作用，可以作为潜在的生物标志物或治疗靶点。所有这些研究表明，miR-29表达下调至少是病理模型中心肌纤维化的最重要原因之一，miR-29表达对心肌纤维化有拮抗作用[22]。Melo和Yang等[35,36]发现游泳和丹参酮可以通过在成纤维细胞中上调miR-29来减少纤维化。miR-29具有双重功能:不仅能抑制胶原蛋白的表达防止心肌纤维化，还能诱导诱发心衰的心肌细胞凋亡。这些发现突出了miR-29家族的复杂功能，以及进一步探究miR-29在心肌纤维化中作用的必要性。

2.5 microRNA29与系统性硬化症 系统性硬化症(SSc)是一种临床上以局限性或弥漫性皮肤增厚和纤维化为特征,同时可累及心、肺、肾和消化道等多个内脏器官的弥漫性结缔组织病。Maurer等[37]发现miR-29a在系统性硬化症病人皮肤活检组织、人纤维母细胞及博来霉素诱导的皮肤硬化症动物模型中表达均明显下降，而抑制miR-29a或过表达miR-29a可升高或降低Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白和mRNA水平，提示miR-29可能是治疗系统性硬化症的一个靶点。作为下游介质，miR-29a可以被TGF-β、PDGF-B和白细胞介素(IL)-4抑制，而PDGF-B和TGF-β的下调可以在体内和体内恢复miR-29a水平。进一步的功能研究表明，miR-29a靶向TGF-β-激活激酶1结合蛋白1(TAB1)，这是一种触发组织抑制金属蛋白酶1(TIMP-1)产生的关键细胞因子。miR-29a还可通过TAB1抑制作用降低TIMP-1分泌，并增加功能MMP-1的产生，导致胶原降解。miR-29a的过表达可通过下调胶原蛋白和TIMP-1来逆转SSc成纤维细胞的原纤维化表型，进一步表明miR-29a可能是SSc的治疗靶点[36]。此外，miR-29a通过增加SSc患者的真皮成纤维细胞中Bcl-2相关的蛋白9(Bax)与中Bcl-2比值而诱导凋亡[38]。

2.6 microRNA29与其他疾病 最近的研究显示miR-29可以正反馈调节Wnt/β-catenin信号通路参与机体的骨骼发育及重塑。在成骨细胞分化过程中miR29a/c表达上调，同时伴有Wnt/β-catenin信号通路的活化。加入其信号通路抑制剂Dickkopf-1(Dkk-1)后显著抑制了miR-29a/c表达；进一步研究还发现：增强miR-29a表达后能有效下调Wnt信号通路的抑制剂[如Dkk1，含kringgle跨膜蛋白2(Kremen2)和分泌型卷曲相关蛋白2(sFRP2)]的表达，从而加强了Wnt信号通路，促进干细胞成骨分化[25]。上皮细胞-间充质转分化(EMT)是纤维化的起始和可逆环节，最近还发现miR-29与EMT过程有着紧密联系。在子宫内膜癌肉瘤EMT改变中，除miR-200家族外，miR-29c的表达也是下调的，提示miR-29可能在EMT过程中起着负性调控的作用，通过过表达miR-29可能会抑制EMT而阻止纤维化的发生。最近研究发现在小梁网细胞中TGF-β2能抑制miR-29a/b/c的表达，过表达miR-29b可抑制TGF-β2引起的细胞外基质上调，且miR-29b能同时在启动子、mRNA和蛋白三个水平抑制TGF-β1表达[27]。在瘢痕组织中，miR-29家族表达低于正常皮肤组织。与健康对照相比，miR-29家族，尤其是miR29a，在成纤维细胞中也明显减少。miR-29可以通过调节I型胶原和III型胶原的表达来影响瘢痕形成的发病机制。通过TGF-β1进行预处理成纤维细胞后miR29a显著下调，证明miR-29a/TGF-β1/SMAD信号通路可能在瘢痕的发生中发挥重要作用[39]。循环中miRNA是否影响终末期器官中基因的表达及其诊断或预后价值仍需进一步研究。

3 小结与展望

综上所述，越来越多的证据表明miR-29可通过直接抑制多种细胞外基质成分(主要是胶原蛋白)的表达及参与多条与纤维化相关信号通路的调控在器官纤维化过程中发挥着重要的作用。miR-29在心肌纤维化和肺纤维化患者血清中已被证实是稳定和可检测的。因为miR-29参与了这一过程的调控，并与纤维化程度相关，因此它似乎比其他miRNA更有价值，miR-29可能是一个极具潜力的纤维化诊断及预后评估的新靶点，同时也是寻找纤维化新的治疗靶点的新视角和方向[40-42]。

进一步研究miR-29在纤维化相关疾病中的作用机制将有利于阐明miR-29与疾病发生发展之间的因果关系并为miR-29在疾病预防和治疗中提供应用价值，为miR-29的临床应用提供可靠的理论依据。