浅谈小鼠MCAO 模型制作的心得体会

何天鹏 王冬 王东亮 赵婧 高欣 袁媛

脑血管疾病（cerebrovascular disease，CVD）又名脑卒中，是危害人类健康与生命的常见病和多发病，指由各种原因引起的脑部血液循环障碍、导致的局部或全脑神经功能受损的一种疾病。其中缺血性脑血管病（ischemic cerebrovascular disease，ICVD）约占CVD 的80%，具有发病率高、死亡率高、致残率高、并发症多等特点[1]。ICVD 中以大脑中动脉梗死最为常见[2]。因此，在实验动物身上模拟人类大脑缺血性疾病时，选择合适的动物模型就十分重要。脑缺血模型包括全脑缺血和局灶性脑缺血：全脑缺血模型就是对颈部大动脉进行结扎，所造成的弥漫性脑缺血模型；局灶性脑缺血模型则是对脑部特定血管给予栓子干预，根据栓子来源，可分为光化学诱导、线栓、自体血栓，由于线栓法制作简便，且可控制再灌注，故应用更为广泛[3]。1986 年Koizumi 等[4]首先报道了利用线栓法制备短暂性大脑中动脉阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型，随后Longa 等[5]于1989 年在此方法上做了改进，现今已成为相对成熟的局灶性脑缺血模型。本文旨在对该模型制作过程中多个细节进行探讨，希望能给广大临床科研工作者提供经验借鉴。

一、模型动物选择

1.品系：建议选择C57BL/6 小鼠。国内外有很多专家学者选用sprague-dawley（SD）大鼠，认为大鼠易存活且术后抗感染能力强[6]。但也有研究表明，相对大鼠，小鼠有更多的优势，如容易控制、遗传背景更为单一且便于饲养等特点。更重要的是，更多基于C57BL/6 背景的转基因小鼠被大量使用，存在着更多的科研价值和研究方向[7-8]。因此，在技术条件允许的情况下，建议选择C57BL/6 小鼠。

2.年龄、体质量：推荐选择2 月龄、体质量20～25 g 的小鼠，因为其正处于青年期，身体各部与脑血管发育都相对完善，血管弹性也较好，便于手术操作。此时需注意，年龄与体质量两个条件必须同时吻合，以排除过于肥胖或者因年老血管弹性减弱的老鼠。

3.性别：以雄性为宜，有大量研究表明，雌激素具有舒张血管、抗氧化应激，拮抗兴奋性神经递质的作用，对于脑血管疾病是一种极为重要的保护性激素[9-11]。制作MCAO 模型以及根据实验需要所采用的给药干预，应排除雌激素的干扰。

二、术前准备

术前1 d，实验鼠单笼饲养，饲养温度22℃～25℃，湿度60%±5%，避免互相干扰接触。术前应禁食8 h、禁水4 h，以减少手术过程中的误吸可能[12]。在手术开始前，腹腔注射10%葡萄糖0.5～1 mL，以保证术中老鼠的的能量供给。实验器具应严格消毒，术者严格按照无菌操作进行。手术完成后腹腔注射0.9%氯化钠注射液1 mL，以恢复术中丢失的体液。

三、麻醉药物的选择

麻醉药物的选择对于手术的成败和术后老鼠的存活率至关重要，目前常用的有液体和气体两种。

（一）液体麻醉

液体麻药主要有巴比妥类、氨基甲酸乙酯类、水合氯醛、非阿片类等。

1.巴比妥类：以戊巴比妥钠作为代表，常用剂量为1%，以50 mg/kg 进行腹腔注射，但其镇痛效果不佳，且麻醉深度不易控制，故不建议使用。

2.氨基甲酸乙酯类：氨基甲酸乙酯即乌拉坦，多作为致死性麻药，麻醉时间过长，易造成术后缺氧和CO2潴留，不宜在颅脑手术中使用[13]。

3.水合氯醛：现在大多数实验室使用的是10%的水合氯醛，其操作简便，麻醉深度易于控制。但对于MCAO 手术，笔者不予推荐，因为前期大量的动物实验中动物死亡率过半，原因有以下两点：（1）MCAO 手术采用仰卧位，使用水合氯醛麻醉可以引起呼吸道腺体分泌增多，产生大量黏液，在操作过程中，笔者发现动物多数出现打嗝现象，故术中呼吸抑制是死亡原因之一；（2）动物术后苏醒时间过长，且不易排便，腹部膨隆，解剖后发现，动物肠腔内多处胀气，系水合氯醛过量引起的麻痹性肠梗阻，可导致死亡。

4.非阿片类：多采用盐酸氯胺酮和盐酸甲苯噻嗪的混合物，有条件的情况下，推荐采用此液体麻药。该麻药起效快，镇痛效果强，苏醒较快，不增加气道分泌物，无明显的呼吸抑制且不易留下麻醉后遗症。

（二）气体麻醉

气体麻醉主要为氟烷类，以安氟烷和异氟烷作为代表，其操作更为简便，可以通过调控吸入药物的浓度靶控麻醉深度，麻醉后动物容易苏醒，术后精神状态好，成活率高[14]。气体麻醉是目前性价比最高的麻药，建议推广应用。

四、线栓的选择

线栓的选择是MCAO 模型制备的重要环节。线栓过细，堵不住血管，过粗又容易撑爆血管，所以需要选择适宜长度和直径的线栓。目前很多实验多采用鱼线或尼龙线，自制线栓，虽然节约成本，但笔者认为其是极不科学的，因为手工制作存在个人误差，且小动物血管变异较大，自制的线栓无论是用火烫头的鱼线，还是用硅胶嵌合的尼龙线，都会存在线栓头脱落的现象，将大大降低手术的成功率并延长不必要的手术时间。因此，笔者建议购买专门厂家定制的线刷，且同一根线栓建议避免反复使用。

五、插线方式

大脑拥有丰富的环状侧枝循环血液供给，所以插线方式和深度应严格掌控，必须保证栓塞大脑中动脉起始部，以阻断同侧和对侧双侧的血液循环，保证模型制作的梗死区域即为大脑中动脉供血区。目前常用的插线方式，有颈总动脉和颈外动脉进线两种。

1.颈总动脉插线：颈总动脉插线常用且便于操作，对于初学者建议采用该方式，缺点是手术侧颈总动脉完全被破坏，待线栓取出后，供血来自于对侧基底动脉环，将破坏动物原有血管生理构型，有一定的术后死亡风险。

2.颈外动脉插线：颈外动脉插线具有一定的难度，耗时较长，分离结扎血管较多，且术中易出血，初学者不易采用。但线栓取出后，血供来自于同侧颈总动脉和对侧基底动脉环，即为原来的生理血供方式，术后存活率会大大提高。待操作者熟练后，笔者建议采用颈外动脉插线方式。

3.插线深度：对于20～25 g 的小鼠，插线深度应掌控为0.8～1.2 cm，或者有轻微阻力即可，有条件可以采用多普勒血流仪对术中中动脉血流进行全程监测，切不可插入过深，以免造成蛛网膜下腔出血。

六、手术与苏醒

由于小鼠体积较小、血管较细，所以全程必须采用显微操作，这要求施术者有很好的解剖常识。注意事项包括：（1）操作前必须严格消毒备皮，清除毛发，这些都会对操作视野进行干扰；（2）切开皮肤动作要轻柔，注意不要压迫气管，以及损伤同侧迷走神经；（3）操作时间应严格把控在15 min 以内，时间越长，术中死亡风险越大；（4）在操作时还应采用可控式温度反馈系统，全程监测使用探头测老鼠肛温，以保证老鼠体温在37℃左右。

待线栓插入成功后，固定线栓，连续缝合皮肤切口。这时同样需要注意两个问题。第一，在确定的缺血时间内，应严格保证老鼠处于深度麻醉状态，需注重前期麻醉药的选择和计量，若缺血期间老鼠苏醒，因为疼痛而造成的头部摆动，可能影响线拴在体内的位置；第二，保证体温在37℃，这个时间的温度会影响梗死体积的生成，温度过低，会由于低温保护作用，造成梗死灶体积过小或每只模型体积不一致；而温度过高，动物容易死亡。

七、术后护理

1.术后抗感染：手术后大多数动物死亡会源于术后感染，所以抗感染是重要的护理环节。首先切口周围应严格用碘伏消毒，消毒范围不应低于1.5 cm；同时，从术后当天开始，每天腹腔注射4 万单位青霉素，连续注射7 d；术后生活的笼具垫料也应进行严格的消毒灭菌，垫料需每天更换一次。

2.术后镇痛：术后切口强烈的疼痛，也是实验动物死亡因素之一。在缝合伤口后，可以选择性的以2.5 mg/kg 标准于小鼠尾静脉注射曲马多，以达到镇痛目的[15]。

3.术后饮食：MCAO 术后1 周内，为死亡高发期，其中一个重要的原因就是术后自主进食不佳[16]。术后应采用流食，可以喂养奶粉，或用10%蔗糖代替。如若1 d 内小鼠仍没有进食行为，可以采用灌胃处理。

4.环境温度：术后饲养的环境温度应在27℃±0.5℃，不宜过高，过高会出现灌注流速太大引起的脑出血，湿度为70%±5%，通风良好，避免噪声及动物间的相互干扰。

八、模型评价

手术动物苏醒后，根据Longa 法进行行为学评分，其是模型成功与否且保证一致性的客观指标[5]。具体评分标准：（1）没有神经功能损伤的症状，小鼠能够正常活动、进食，评0分；（2）将小鼠尾巴提起后，右前肢屈曲，评1 分；（3）将小鼠放置于平板上，向右转圈，评2 分；（4）将小鼠放置平板上，用手推向右倾倒，评3 分；（5）小鼠右侧肢体偏瘫，不能自发行走意识朦胧或丧失，评4 分。评分在1～3 分的小鼠认为MCAO 模型成功；评分为0 分、4 分的小鼠建议予以剔除。

综上所述，MCAO 模型是研究缺血性脑损伤的经典老鼠造模模型，但在MCAO 制作过程中，并没有统一的评价标准。笔者经过反复实验并从失败中积累经验总结作一综述，希望能为从事相关研究的科研工作者提供借鉴。本课题组MCAO模型制备中还有很多不完善的地方，在今后的实践中也会不断努力完善，为探索缺血性脑损伤疾病的机制和改进治疗干预的方法起到推动作用。

志 谢

感谢甘肃省人民医院重症医学一科、甘肃省人民医院麻醉手术科、甘肃省人民医院临床研究与转化医学研究所、兰州大学生命科学学院、甘肃中医药大学动物实验中心的各位老师以及同事对本次实验的合力资助与技术支持！