脑小血管病脑白质损伤动物模型

董成亚，王伊龙，2，刘向荣

脑小血管病（cerebral small vessel disease，CSVD）指包括位于脑实质和蛛网膜下腔的所有血管结构发生病理改变，引起的脑实质缺血或出血性损伤[1]。CSVD影像学上表现为腔隙病灶、脑白质高信号、脑微出血、近期皮层下小梗死灶及脑萎缩等异常信号。其中，脑白质高信号，即脑白质弥漫性损害是CSVD的标志之一，临床研究表明，脑白质高信号常与患者认知功能下降乃至血管性痴呆有关[2-3]。合适的动物模型对CSVD相关脑白质损伤的机制研究意义重大。本文主要描述具有脑白质损伤的脑小血管病动物模型的建立，旨在为CSVD脑白质损伤相关基础研究提供参考。

1 单一型动物模型

1.1 双侧颈总动脉狭窄动物模型 通过手术在小鼠双侧颈总动脉周围放置微弹簧圈可诱导慢性颈总动脉狭窄动物模型（bilateral common carotid artery stenosis，BCAS）。微弹簧圈的内径决定颈总动脉狭窄的严重程度，通常用于BCAS的微弹簧圈内径为0.16～0.2 mm，内径越小，脑血流下降速度越快，同时小鼠因颈总动脉急性收缩而死亡的比例越高[4]。BCAS能够模拟人类因动脉管腔狭窄、慢性低灌注等因素导致的CSVD，但缺乏CSVD脑小血管病理学改变如纤维素样坏死、玻璃样变、淀粉样物质沉积等。

使用内径0.18 mm微弹簧圈制作的小鼠BCAS模型，与术前基础值相比，术后2 h小鼠脑血流量减少60%～70%，但1～3个月后脑血流量可恢复80%～85%。微弹簧圈对血压无明显影响。术后3 d，观察到BCAS小鼠血脑屏障通透性增加[5]；术后14 d，可见胼胝体白质空泡化，免疫组化染色显示髓磷脂碱性蛋白（myelin basic protein，MBP）丢失[6-7]。BCAS小鼠还可表现出小胶质细胞活化和基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）-2表达增加。有研究表明，MMP-2基因表达水平与脑白质损伤的严重程度、血脑屏障破坏及神经炎症水平成正相关[8-9]。此外，随着脑慢性低灌注时间延长，BCAS小鼠神经功能评分显著下降；术后6个月时，海马葡萄糖利用明显降低；8个月时，可见海马萎缩并伴有细胞固缩和凋亡[10]。

1.2 双侧颈总动脉不对称狭窄模型 双侧颈总动脉不对称狭窄模型是通过手术在小鼠右侧颈总动脉放置一个内径为0.5 mm的Ameroid慢性缩窄环，左侧颈总动脉周围放置一个微线圈（内径为0.18 mm），造成双侧颈总动脉不对称狭窄模型（asymmetrical common carotid artery stenosis，ACAS）[11]。右侧的Ameroid慢性缩窄环由于吸收周围的组织液逐渐膨胀，导致被箍的右侧颈总动脉逐渐狭窄，大约在术后28 d发生闭塞[11-12]。左侧的微线圈则导致同侧半球脑血流量降低，术后1周可达平台期。ACAS模型在术后2周和4周，右侧（放置Ameroid缩窄环）皮质和皮层下脑血流量均低于左侧半球脑血流量。该模型相对于BCAS模型，避免了动物因颈总动脉急性收缩造成的死亡率过高问题，但同样缺乏CSVD脑小血管病理学改变。

ACAS模型中，左侧（放置微线圈）脑部血流量减少较轻，可见明显的白质疏松和胶质细胞增多；在右颈总动脉缩窄环侧，组织病理学检测也发现有海马区的小胶质细胞活化和神经元丢失[13]。有文献报道，在右侧皮层下区域，包括深部白质和海马区可见多发性梗死[13-14]。此外，通过Y迷宫测试，发现ACAS小鼠空间工作记忆和自发活动受损明显，术后28 d可出现认知功能障碍[11]。因此，ACAS适用于CSVD中出现的脑白质梗死并伴有运动缺陷和痴呆的动物模型的行为学评估。

1.3 脑淀粉样血管病模型 脑淀粉样血管病（cerebral amyloid angiopathy，CAA）是指在大脑和软脑膜血管壁出现淀粉样纤维沉积，主要是β-淀粉样蛋白（β-amyloid，Aβ），导致继发性血管退行性改变[15]。CAA主要表现为皮质微出血相关的白质改变和进展性痴呆，是与年龄老化相关的一种脑血管病[16]。该模型适合于因Aβ沉积引起的CSVD中血管病变和脑白质损害的发生机制研究。

CAA表型相关的转基因小鼠模型主要通过基因调控淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein，APP），引起Aβ合成增加或发生突变。其中，一类是散发性CAA动物模型，如野生型过表达Aβ的APP Swedish小鼠（APP/Sw，Tg2576和APP23小鼠）易发生脑淀粉样血管病[17-18]。另一类动物模型可模拟遗传性CAA，如Dutch APP小鼠是APP中E693Q基因位点突变所致，该模型小鼠主要表现为脑血管病理改变，在脑实质中几乎不存在淀粉样蛋白，伴发血管肌细胞变性、脑血管淀粉样变、神经炎症和出血[19]。同样，Aβ中Dutch E22Q和Iowa D23N基因突变导致遗传性CAA，伴发大量淀粉样斑块沉积[20]。而含有Swedish K670N/M6711和血管性Dutch/Iowa E693Q/D694基因突变的Tg-SwDI小鼠，仅在大脑血管表现出纤维性Aβ沉积，该模型小鼠有脑小血管淀粉样变、脑白质病变及明显的神经炎症反应，包括脑血管密度降低、脑血管细胞凋亡及反应性星形胶质细胞增多和小胶质细胞活化[21-22]。

1.4 Notch3转基因小鼠模型 伴有皮质下梗死和白质脑病的常染色体显性遗传性脑动脉病（cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy，CADASIL）是一种由Notch3基因突变造成的单基因遗传性脑小血管病[23]。该模型的特征性病理变化是在电镜下可观察到中小动脉平滑肌细胞表面有嗜锇颗粒（granular osmiophilic material，GOM）沉积，导致中小动脉退行性变和脑血流量下降[24]。CADASIL发病由Notch3单基因突变所致，Notch3是在成熟动脉血管壁肌细胞中发现的一种大的跨膜受体。CADASIL Notch3转基因小鼠模型可以模拟非高血压缺血性CSVD的遗传现象。

文献报道有两种CADASIL相关表型的基因工程小鼠模型，它们都是模拟患者中Notch3基因Arg169Cys位点替换导致的CADASIL。其中一种转基因小鼠携带表达Notch3类似物的人工染色体，可导致Notch3的R169C点突变[25-26]。5月龄Notch3R169C小鼠开始出现GOM沉积，12月龄开始出现星形胶质细胞增生，18～20月龄小鼠胼胝体、纹状体、内囊和海马出现广泛的脑白质病变[25]。研究发现，随着年龄的增长，Notch3R169C小鼠的脑白质早期病变呈进行性和节段性，以髓鞘内微泡形成（直径＜1 μm）和水肿为主，与局灶性髓磷脂降解有关；同时，在脑白质病变部位发现小胶质细胞清除髓鞘碎片的能力下降[27]。

另一种CADASIL小鼠模型是利用基因敲入系统将正常小鼠Notch基因替代为Notch3Arg170Cys，即Notch3基因的等位突变[28]。此方法构建的Notch3Arg170Cys株小鼠在9月龄时开始出现GOM沉积，之后，出现一些卒中样病变的症状。Notch3Arg170Cys株小鼠的大脑动脉和外周动脉（如尾动脉）均可发生退行性病变。组织病理学分析显示，该模型存在微出血、血栓形成、纤维胶质细胞增多症和微梗死。此外，在有些个体中，自13月龄起小鼠运动功能发生障碍，主要表现为肢体轻瘫和步态不稳[29]。

1.5 自发性高血压大鼠模型及易卒中亚型大鼠模型 自发性高血压大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）是对成年高血压Wistar大鼠进行培育而获得的[30]。SHR能够模拟临床患者高血压引起的CSVD早期发病阶段。而自发性高血压易卒中大鼠（spontaneously hypertensive stroke-prone rats，SHRSP）是在SHR基础上培育出的亚系，寿命较SHR短，卒中发生率高达80%以上。组织病理学证实，SHRSP的血管病变与人类CSVD类似，是目前较理想的CSVD模型[31]。但是，SHR及其易卒中亚型均缺乏严格的正常血压对照，使得SHR和SHRSP在高血压遗传背景相关研究中受到限制[32]。

Daniel Kaiser等[33]对比研究了SHR和非高血压Wistar Kyoto（WKY）大鼠认知功能和神经炎症，发现在SHR生命里的前三分之一即存在血脑屏障功能受损、脑白质损伤和小胶质细胞活化。SHR还表现为全脑萎缩、皮层下病变、皮层梗死出血，血管周围间隙增大等[34]。该模型可表现出与脑白质损伤有关的空间工作记忆和注意力等执行功能缺陷，以及由于脑容量减少而导致的运动障碍[35]。相比较SHR，SHRSP中脑白质病变更为常见，且随着鼠龄的增长白质损伤范围增大，20周龄时，胼胝体、内囊和尾状核出现早期白质病变；24周时，白质疏松呈囊状，尤其是在富含有髓纤维的内囊区，可见明显的空泡形成[36]。

1.6 易卒中型肾血管性高血压大鼠模型 易卒中型肾血管性高血压大鼠模型（stroke-prone renovascular hypertensive rat，RHRSP）是我国学者曾进胜应用内径为0.3 mm的银夹夹闭双侧肾动脉诱导的稳定高血压大鼠模型[37]。SD大鼠在行双肾双夹术后血压缓慢升高，至12周达到峰值，此后维持在200 mm Hg左右。该模型能够模拟CSVD高危因素高血压及相应的脑小血管病理学改变。

RHRSP表现出的脑白质病变与人类慢性高血压性脑白质病变发病过程相似。病理染色显示脑白质疏松、胶质细胞增生、神经纤维缠结或缺失。其中，病变最明显的部位在胼胝体。脑小血管HE染色可见小血管玻璃样变、管壁结构消失和管腔狭窄。此外，在RHRSP中可观察到血脑屏障破坏及大鼠空间学习与记忆能力下降[38]。

1.7 高血压灵长类动物模型 非人类灵长类动物有着较大的多脑回大脑、丰富的脑白质，以及与人类认知类似的复杂行为，是医学研究领域非常珍贵的一种实验物种[39]。有学者以猕猴为实验对象，成功建立胸主动脉狭窄所致高血压模型猴，其神经病理学上最主要的损伤是：形状不规则的微梗死（直径＜500 μm），伴有局部胶质细胞增生，散布于大脑皮层灰质和白质、脑干及小脑，尤其是前额叶白质[40]。在该模型猴中，除局部小胶质细胞活化外，未见其他血管病变。在手术后12个月左右，出现认知功能下降[41]。动物认知功能障碍的严重程度与收缩压和舒张压的升高有关。

2 复合型动物模型

2.1 自发性高血压大鼠/双侧颈总动脉渐进性狭窄模型 Akihiro Kitamura等[42]将Ameroid收缩环套在自发性高血压大鼠左、右侧颈总动脉上，造成双侧颈动脉逐渐闭塞的慢性高血压伴发脑灌注不足CSVD动物模型（SHRs subjected to the bilateral CCA gradual occlusion，SHR-2VGO）。术后7 d，SHR-2VGO大鼠脑血流逐渐下降，达到基线水平的68%。术后28 d，SHR-2VGO大鼠表现出缓慢进展的脑白质病变和空间工作记忆受损；组织染色显示脑白质中有脱髓鞘改变、反应性星形胶质细胞和小胶质细胞增多。该模型克服了同时结扎双侧颈动脉出现的脑血流急剧下降导致的死亡率过高的问题，能够较好地模拟CSVD中高血压和慢性脑低灌注引起的脑小血管病理学改变和白质损伤。

2.2 易卒中型肾性高血压大鼠/改良的双侧颈总动脉狭窄动物模型 林晶等[43]通过先行双肾双夹术制作RHRSP模型，12周后间隔1周先后进行双侧颈总动脉夹闭术，制作易卒中型肾性高血压大鼠/改良的2VO模型（stroke-prone renovascular hypertensive rat/modified 2 vessel occlusion，RHRSP/Modified 2VO）。RHRSP/Modified 2VO具有高血压及脑小血管病理改变，能较好地模拟CSVD脑白质病理改变。术后12周，RHRSP/Modified 2VO表现出脑小动脉管壁增厚、血脑屏障破坏，免疫组化染色显示I型和IV型胶原沉积在脑小静脉[44]。此外，RHRSP/Modified 2VO大鼠还表现出髓磷脂碱性蛋白表达减少和脑白质损伤分级增加，Morries水迷宫测试中出现明显空间记忆功能受损[43]。

2.3 高脂血症/双侧颈总动脉狭窄动物模型Eek-Sung Lee等[45]在载脂蛋白E基因敲除（apolipoprotein E knockout，ApoE-/-）小鼠双侧颈总动脉周围放置微弹簧圈，建立高脂血症合并慢性颈总动脉狭窄动物模型。造模后，组织病理学发现模型组小鼠有脑白质损伤、多发性微梗死和星形胶质细胞增生；脑微循环研究发现模型小鼠脑微血管密度下降，血脑屏障破坏；此外，旷场实验和迷宫实验发现该模型动物空间工作记忆和自发运动功能下降，认知功能也明显受损。该小鼠动物模型可用于探究高脂血症引起的慢性低灌注性CSVD的发病机制及治疗靶点。

具有白质损伤的脑小血管病动物模型不仅可以用来研究白质改变和CSVD之间的关系，而且也可用来研究不同发病机制、治疗药物与CSVD疾病严重程度之间的关系，对于疾病的预防、诊断及治疗有着重要的作用。动物模型制作的方法多样，没有统一的衡量标准，各种不同模型制备方法也各有其优缺点，需要根据不同的研究目的来选择和制备合适的CSVD动物模型。

【点睛】本文总结了经由颈总动脉狭窄、高血压、脑淀粉样血管病、Notch3转基因等方法建立脑小血管病白质损伤动物模型制作的方法及其在基础研究中的应用。