耳鸣动物模型概述

李金飞 贾志姣 综述 丁雷 审校

耳鸣动物模型的建立，对于其机制、病理及临床诊治研究至关重要。笔者查阅大量相关文献报道并予以整理归纳，进行综述以供参考。

1 现代医学耳鸣造模发展

1.1 经典造模法

1.1.1 饮水抑制 Jastreboff等［1］在1988年用饮水抑制法，背景噪声停止即刻对大鼠进行电击刺激，经过一段时间强化训练，形成“背景噪声停止大鼠舔水减少”的条件反射，统计背景噪声停止前后各1分钟内大鼠的舔水率，证实水杨酸可致大鼠感受到耳鸣，这一模型已得到广泛承认，拓展了耳鸣的深入研究。

1.1.2 跳台反射 Guitton等［2］训练大鼠建立一种声音刺激-足底电击-跳台逃避的条件反射，通过观察大鼠无声条件下频繁的跳台逃避行为行为（假阳性反应），同样证实大鼠注射水杨酸钠后感受到耳鸣。

与饮水抑制法相比，跳台反射减少了大鼠抑水过程中全身状态的影响，且影响因素可控，适用于对动物身体状态有特殊要求的手术干预等情况；大鼠对条件反射声音敏感，记忆时间可长达6～7天，适用于周期相对较长的耳鸣实验。

1.1.3 声音惊吓刺激 Turner等［3］发现惊吓可由噪声产生--听觉惊跳反射，并制作了声音惊吓刺激反射(whole-bodystartle reflex，WBS反射)大鼠耳鸣模型。该模型对动物状态影响更小，且无需训练，建模过程的简化可节省大量时间；但位于脑干下部的惊吓反射中枢与耳鸣相同中枢水平的交叉，可能影响实验结果，故需设计对照组。

1.2 经典造模改进

饮水抑制法操作复杂，设备条件要求较高，大鼠特定时间内舔水次数可达350～1600次，甚至6000～8000次，如果没有特殊设备根本无法检测。从应用角度出发，用其他行为学指标代替舔水率，在此基础上进行改进：Bauer等［4］食物奖励法，观察口服水杨酸钠溶液大鼠的摄食次数；Ruttiger等［5］给水奖励法，记录穿梭箱内大鼠来回穿梭找水的次数；李明等［6］食物抑制法，观察大鼠踏板取食的次数；贾明辉等［7］研究表明，行为学指标“舔水时间或次数”代替“舔水率”，均能够很好的证明大鼠感觉到耳鸣的存在。Heffner还建立了单侧耳鸣动物模型[8]，即给予有渴觉的仓鼠左右两个不同方向的声刺激，当仓鼠成功辨明声音来源的方向并向相应的方向移动时给予饮水奖励，而移动方向错误时给予微弱的电击。

随着对跳台反射模型相关影响因素的研究，该模型得到不断的完善。梅国江等［9］用相互贯通的六边形小室训练器替代跳台进行电击刺激，克服了同类行为试验方法的缺陷；张恩柱等［10］将刺激时间及训练间隔时间加以适当改进，提供了更为方便、可行、有效的耳鸣建模法，具有成功率高、稳定且可操作性好的优点，已成为建立耳鸣模型的一个方向，并广泛应用于耳鸣发生机制及药物对耳鸣治疗效果观察方面的研究［11］。

1.3 耳鸣诱发方法

耳毒性药物法和噪声，仍是目前较多采用的耳鸣诱发方法[12]。

1.3.1 耳毒性药物法 水杨酸钠注射2小时后，急性耳鸣可作为首发或唯一症状，因其较易通过血脑屏障作用于听觉中枢，调节五羟色胺和γ-氨基丁酸（GABA）活动而诱发耳鸣［13，14]。水杨酸盐引起耳鸣的成功率高、操作简单、全身副作用小，产生的耳鸣声音特性与10 kHz、70 dB的纯音基本一致［15］，能够被优化同步记录神经震荡活动，高效、客观的检测到大鼠是否感知耳鸣［16］，并有国内学者在此造模基础上发表了多篇报道［17，18]。此外，应注意造模过程中背景噪声尽可能与其声学特点相一致。奎宁与水杨酸钠引发的动物耳鸣行为相似，可解释为动物感受到耳鸣的结果。Ochi等[19]发现奎宁和水杨酸钠对猫听皮层神经元活性的影响相似，推测给药后神经元自发放电同步化的增加可能与耳鸣有关。

1.3.2 强噪声暴露法 噪声虽然可使毛细胞保持完整性，但会损害相应的传入神经末端，并进一步损害蜗神经，使神经同步放电活动增加，传入兴奋抑制失衡，导致中枢神经的重塑[20，21]；Szczepaniak[22]发现强噪声降低GABA对下丘神经元的影响，导致下丘可塑性的改变，从而引发耳鸣和听觉过敏。

1.3.3 手术破坏法 传入神经阻滞可能是引发耳鸣的机制，因手术破坏耳蜗及听神经导致听中枢重塑和后期听神经元活性增高，可被听中枢解释为耳鸣。观察发现[23]，接受手术的患者中耳鸣的发生率仅为50%，若此法应用于动物造模，推测仅可能导致部分动物耳鸣，在耳鸣与变化的代谢活性之间不能建立确切的联系。

1.4 造模判定

动物行为学指标是判定耳鸣模型成功与否的重要评价方法。饮水、舔食、逃避等行为都是动物容易习得的，训练动物对声音刺激和无声状态做出不同的反应，强化形成条件反射后进一步进行耳鸣诱导，观察它们无声状态时的行为，若动物感受到耳鸣，则它们的行为应该与之前有声音刺激时相同［24］。

2 传统医学耳鸣造模应用

2.1 应用现状

作为中医药造模因素的病因尽可能满足两个条件：①病因必须是证候模型的主因；②病因所致病变既主要证候。若一味采用西医耳鸣病理模型，受“外因论”与“局部定位论”的束缚，会出现临床观察与动物实验结果的不同，不能够很好的阐明耳鸣中医药治疗机制。

“辨证论治”是中医精华，而辩证又是论治的前提，证型不同则治疗有别，准确辩证才能提高疗效。随着中医药研究的重点从病向证转移，复方和中药的使用主要是针对“证”，因此，建立适合中医药基础理论研究的中医动物模型非常重要。

2.2 肝郁脾虚证候模型探索

通过对名老中医大宗耳鸣医案的证型及用药频率分析［25，26］，发现不同于传统肾虚耳鸣证型，当前耳鸣肝郁脾虚证型多见，是肝失疏泄、脾失健运所表现的证候。有关肝郁脾虚证动物模型的复制有四氯化碳(CCl4)注射法［27］、高脂饲料饲喂与CCl4注射联合造模法［28］、夹尾激怒加苦寒泻下法［29］、限食限动加醋酸结肠内注射法［30］、利血平皮下注射法［31］；但上述方法均以药物损伤致病，有驳于中医发病学原理。

根据流行病学调查，饥饱失宜、郁怒是肝郁脾虚证的主要病因，可作为动物模型的造模因素。李艳彦等［32］用慢性束缚应激+过度疲劳+饮食失节的复合方法，复制中医肝郁脾虚证大鼠模型：慢性束缚使大鼠情绪受抑而近情志不遂，致肝郁；游泳活动致疲劳，隔日喂食致饥饱失常，二者相加类同于中医饮食劳倦，损伤大鼠脾胃。在模型评价上，采用动物宏观行为学指标(症)与生理、生化中涉及肝郁、脾虚证有关的指标相结合，在造模不同阶段进行动态观察，全面掌握模型的生物学特点。观察还发现，肝郁、脾虚、肝郁脾虚3个证候模型均存在一定程度的免疫功能异常，大鼠血清IL-2、IL-6及胸腺、脾脏指数均显著降低。但同中有异：肝郁证主要涉及胸腺功能下降及免疫应答早期细胞因子释放不足，血清IL-1显著降低、TNF-a显著升高；脾虚证还涉及细胞免疫功能抑制，脾T淋巴细胞增殖率显著降低、血清IL-I显著升高；肝郁脾虚证不仅包括了肝郁和脾虚的免疫异常环，可能还伴有体液免疫功能抑制，血清TNF-a和IL-1均显著升高，脾T淋巴细胞增殖率显著降低［33］；此外，大鼠血清T3、T4、TRH、TSH均见显著性降低［34］。

借鉴于已有经验［32］，在跳台反射基础上联合慢性束缚+过度疲劳+饮食失节复合病因造模法，制造“肝郁脾虚耳鸣证候”大鼠模型，使得“病症”及“证”的生理及病理状态更加符合中医病因病机原理。

目前，耳鸣尚无客观诊断指标，按照上述动物模型制作原理，通过行为学观测能够证明动物确实感受到耳鸣，虽然尚有不足之处，但其作用不可替代。仅以此文总结耳鸣造模的方法，旨在加深对耳鸣的认识，为耳鸣的发病机制和治疗等相关研究提供帮助和参考。