高效液相色谱法测定蜂蜜中氯霉素残留

■ 张微微 文奇男 殷庆庆 柴新义 董艺凝*

（1.滁州学院生物与食品工程学院，安徽滁州239000；2.沈阳市友发实业有限公司，辽宁沈阳110144）

氯霉素是一种广谱抗生素，由于其价格便宜、疗效快，被广泛应用于畜禽和水产品疾病的预防与治疗[1]。但因其自身无法代谢，在畜禽体内大量积累，发生严重副作用，因此各国对氯霉素药物在动物产品中做了严格的残留限量，如欧盟规定动物身体中的氯霉素残留量绝对不能超过0.01 mg/kg[2-3]。

随着畜牧业规模化、集约化的发展，导致疾病传播率高，病菌种类多，畜禽临床治疗十分棘手[4]。而作为新型饲料资源的蜂蜜等主要蜂产品，由于其天然性、营养性、无抗性、排泄物少等特点，必然受到畜牧业的青睐[4-5]。研究指出饲用蜂蜜可以促进动物生产性能，还可以提高免疫力，抑制肠道致病菌群的生长等作用[4，6]。但因病虫害、气候等外界因素影响使得蜜蜂人工饲料中滥用药物，造成蜂蜜中氯霉素含量超标，使得其饲用价值受到一定的威胁。

目前，测定氯霉素残留量的方法有酶联免疫法（ELISA）[7]、气相色谱法（GC）[8]、气质联用法（GC-MS）[9-10]、液质联用法（LC-MS）[10-19]和液相色谱法（LC）[20-22]、毛细管电泳法[23]等多种方法。ELISA法和毛细血管法快速简单，但只适合初筛，灵敏度低，无法做限量验证。质谱检测精确，但耗时长，样品前处理复杂，检测成本过高，不宜推广。当前的HPLC法由于样品处理繁琐，误差较大限制了方法的通用性。因此，本研究开发一种简单快捷、经济适用性强的高效液相色谱测定蜂蜜中的氯霉素方法，为快速测定饲用蜂蜜氯霉素含量奠定理论指导作用，也为畜牧业的安全生产提供了保障。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

氯霉素标准样品，甲醇（HPLC级色谱纯），乙腈、蒸馏水、乙酸乙酯、NaCl、MgSO4、NaOH、醋酸铵、磷酸氢二铵均为国产分析纯，蜂蜜（5种不同品牌）购自超市。

1.2 主要仪器设备

天瑞高效液相色谱仪（配有紫外检测器；江苏天瑞公司）、xbridge TMC18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、50 μl微量进样器、离心机、漩涡混匀器、超声波仪、水浴锅、氮吹仪、移液管、圆底烧瓶、分液漏斗、铁架台、1 ml注射器、有机膜和水膜。

1.3 实验方法与步骤

1.3.1 氯霉素标准溶液配制

首先称取25 mg的氯霉素标准样品放置于25 ml的容量瓶中，接着用甲醇定容至刻度线，此时氯霉素的质量浓度就是1 mg/ml。然后取2.5 ml浓度为1 mg/ml的氯霉素标准溶液于25 ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，此时的质量浓度为100 μg/ml。然后按梯度稀释，配制氯霉素标准溶液浓度分别为10、5、2、1 μg/ml和 0.1 μg/ml。最后将浓度为 10、5、2、1 μg/ml和0.1 μg/ml的氯霉素标准溶液储于冰箱中备用。

1.3.2 液相色谱条件

色谱柱：xbridge TMC18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)、检测波长278 nm、柱温40℃、流速0.8 ml/min、进样量20 μl。流动相比例：V（甲醇）∶V（水）（0.2%磷酸氢二铵缓冲液，pH值5.0）=40∶60。

依据以上色谱条件，检测流动相pH值、流速、样品前处理等因素对氯霉素分离效果的影响，确定最终色谱条件。通过标准曲线测定、精密度实验、重复性实验、回收率测定考察仪器方法精密性、准确性和稳定性。

1.3.3 蜂蜜样品前处理

① 方法1：先用NaOH进行碱化蜂蜜样品，再用乙酸乙酯来萃取蜂蜜中的氯霉素。

先称取10 g的蜂蜜样品于50 ml的塑料离心管中，接着加入5 ml蒸馏水，用漩涡仪震荡混匀，再加入20 ml的乙酸乙酯溶液，涡旋2 min使其充分混匀。再超声水浴锅中超声振荡30 s，分别快速加入2.0 g干燥NaCl和1 g NaOH，并立即涡旋振荡2 min混匀，无砖红色沉淀最好，超声水浴提取2 min。4 000 r/min离心5～10 min，分离取上清液。再次向剩下的残留物中添加20 ml乙酸乙酯，重复两次上述提取步骤，将上层提取液合并在100 ml的三角烧瓶中。35℃水浴旋转蒸发至干，用2 ml乙腈把白色残留物从蒸发皿的壁上转移到5 ml离心管中，再加入0.15 g MgSO4，并振荡30 s。4 000 r/min的转速下离心1～2 min，将清液倒入于进样瓶中，用0.45 μm有机滤膜过滤后的溶液用高效液相色谱仪进样分析测定。

②方法2：样品先用水溶解再用乙酸乙酯来提取、最后用氮气吹干来提取氯霉素。

先称取适量待测样品15 g，放入100 ml的三角烧瓶中，然后加人30 ml乙酸乙醋，用漩涡仪旋涡振摇混合均匀后，用超声提取仪进行超声提取3 min。接着用分液漏斗移出上清液，再向剩下的残渣中加人适量乙酸乙酯，与上述操作相同，提取两次，超声提取时间可以随着提取次数的增加逐渐递减，三次所得上清溶液合并入圆底烧瓶，于80℃水浴蒸发成快干状态，剩余的溶液再用氮气吹干，瓶中残留的白色物质加水振摇溶解，0.45 μm有机滤膜过滤后高效液相色谱仪进样分析测定。

2 结果与讨论

2.1 液相色谱方法的建立

2.1.1 流速优化

一般情况下流速由色谱柱的内径大小直接来决定的，内径比较大的就会选择较大流速，这样样品在色谱柱中停留分析的时间就会相对较短，内径较小的就会选择较小流速，一般来说流速对色谱分离效果的影响程度不是很大。提高样品在柱子中的流速可以提高分析的速度，但是样品在柱子中的流速根据其性质不同也会有不同的最大限制速度。降低样品在柱子中的流速虽然可以提高样品组分间的分离度，但是会延长分离的时间并且降低柱子的效能。本实验通过研究流速对色谱分离及其影响，并且对于流速的影响做了全面而又细致的考察。最后选择当pH值相同时，0.7、0.8 ml/min这两种不同流速作为考察对象，考察了不同流速对分离时间和分离度的影响，结果见图1和图2。

由图1和图2可以看出，当流速为0.7 ml/min时，出峰时间为11.46 min，峰图有稍微的拖尾现象；当流速为0.8 ml/min时，出峰时间为10.08 min，峰图的拖尾现象不明显。相比而言当流速为0.8 ml/min时，它的出峰时间有所缩短，峰图效果较好，因此本实验研究选择流速为0.8 ml/min。

2.1.2 流动相及pH值的选择

图1 流速为0.7 ml/min时的色谱图

图2 流速为0.8 ml/min时的色谱图

C18柱是作为一种反相填料最为常见，其表面残留的硅羟基pka约为4.7，采用磷酸盐作为流动相时需要在其中加入酸，使流经C18柱的流动相pH值在5以下，就会抑制流动相中硅羟基的解离，从而调节目标物分子状态，获得良好蜂形。从分子结构上可以看出氯霉素分子中含有氨基和羟基，所以流动相的解离状态和流动相的pH值是密切相关的，因此控制流动相pH值，使其在色谱柱上获得良好的保留从而显现较好的峰型是十分重要。

本实验研究中考察了在相同的流动相情况下，流动相不同的pH值，其分别为4.0、4.5、5.0时，氯霉素的提取状况，不同的pH提取效果见图3、图4、图5。

图3 pH值4.0时的色谱图

图4 pH值4.5时的色谱图

图5 pH值5.0时的色谱图

当pH为4.0的时候，浓度为2 μg/ml氯霉素标准品的出峰时间是10.27 min。峰图有稍微的拖峰现象。

当pH为4.5的时候，浓度为2 μg/ml氯霉素标准品的出峰时间是10.58 min。峰图有稍微的拖峰现象。

当pH值为5.0的时候，浓度为2 μg/ml氯霉素标准品的出峰时间是10.08 min。峰图无明显的拖峰现象。由上面三幅对比图可见pH值为5.0时氯霉素样品的峰型最好，仪器的灵敏度也明显提高，出峰时间有所缩短。

2.2 样品前处理条件优化

2.2.1 方法初确定

实验之前大致选择了两种方法作为选择进一步优化实验的基础（方法见1.3.3），对所得样品前处理产物进行色谱分析，分析条件见1.3.2，实验所得的色谱图如图6所示。

由上图6可见，方法1其色谱图的分离程度不高，方法2色谱图的峰形较好，因此选择第二种方法进行进一步的优化。

2.2.2 方法的进一步确定与优化

由于样品前处理添加水的体积和提取时加的乙酸乙酯的量对氯霉素的提取浓度有影响，本实验利用两因素三水平实验，研究这两种因素对实验结果的影响，结果分析如表1所示。

用statistic分析表中数据，P＜0.05差异有显著意义。由表1可知，当蜂蜜∶水=2∶1，蜂蜜∶乙酸乙酯=1∶2时，所提取氯霉素浓度最高，提取效果较好。

2.3 标准曲线及线性范围

在采用高效液相色谱对目标物进行定量分析时，需要制作出工作曲线。将氯霉素标准液梯度稀释，配制成不同浓度的标准工作液（1.3.1中方法制备）用1.3.2中所述的色谱条件进行检测，准确吸取浓度为0.1、1、2、5 μg/ml和 10 μg/ml的标准溶液 20 μl，用有机膜过滤后注入液相色谱仪中，记录色谱图中的数据并计算，测定峰面积。以峰面积（Y）对进样浓度（X）进行线性拟合，获得的标准曲线方程：Y=4 236.2X-814.96，在 0.1～10.0 μg/ml浓度范围相关系数 R2为0.999 5，线性关系良好。

2.4 精密度实验与检出限

精密吸取标液10 μg/ml，平行测定5次，然后计算各组分相对标准偏差（RSD）为0.8%。

式中：CL——检出限；

M——标准曲线在低浓度范围内的斜率；

Sb——为空白标准偏差；

K——置信因子。

根据上述公式计算出检出限为0.001 mg/kg，均满足分析要求。

2.5 重复性实验

图6 方法色谱图

表1 两因素三水平分析水和乙酸乙酯对提取氯霉素的影响（μg/g）

称取蜂蜜样品5份，每份15 g，按1.3.3样品处理方法操作，测定峰面积，计算含量，获取RSD为0.5%。

2.6 回收率实验

取已知氯霉素浓度的蜂农蜂蜜15 g向其中添加浓度分别为130、260、660 μg/kg的氯霉素溶液各2 ml进行加标回收实验，按1.3.3第二种方法进行样品前处理，按1.3.2中V（甲醇）∶V（水）（0.2%磷酸氢二铵缓冲液，pH值5）=40∶60的色谱条件进行实验。每个加标水平重复3次。氯霉素回收率结果见表2。其回收率为84%～93%，相对标准偏差4.2%，满足线性分析要求。

表2 蜂蜜中添加不同浓度标样所测回收率

3 结论

为了将本方法应用于市场，我们对市场上的蜂蜜样品进行抽检，共抽检了5份。样品检出80%略超出我国规定蜂蜜中氯霉素的检出量（＜0.3 mg/kg），差异不显著，但是高摄取会造成一定药物残留。通过以上研究得出，蜂蜜样品需将水与蜂蜜（1∶2）混合，制作成蜂蜜水溶液，然后用乙酸乙酯与蜂蜜水溶液（2∶1）萃取氯霉素，接着用氮气吹干，再以水溶解样品。该样品前处理方法简单，得率较高。其次，色谱优化条件为：0.2%的甲醇-磷酸盐缓冲液（40∶60）为流动相，流速为0.8 ml/min，柱温40℃，紫外线检测波长为278 nm。采用本方法进行检测时，氯霉素的检出限为0.001 mg/kg，在0.1～10.0 μg/ml浓度范围内氯霉素标准液的相关系数R2=0.999 5，呈良好的线性关系。本结果为饲用蜂蜜中氯霉素残留量测定提供了一种简便快捷并且准确的色谱方法，并对畜禽业的安全生产提供了保障。