凡纳滨对虾血细胞蛋白制备及其双向电泳体系的建立

■范兰芬 王安利

（1.华南农业大学海洋学院，广东广州510642；2.华南师范大学生命科学学院广东省水产健康安全养殖重点实验室生态与环境科学广东普通高校重点实验室，广东广州510631）

蛋白质组（Proteome）是由澳大利亚Macquarie大学的Wilkins和Williams等人于1994年提出，广义上指由一个细胞或一个组织的基因组所表达的全部相应蛋白质。蛋白质组学以基因编码的所有蛋白质为研究对象，从整体水平研究蛋白质的组成及其变化规律，从而深入了解有机体的各种生理和病理过程。因此蛋白质组学的研究可能更好地帮助人们了解生命的本质，各器官的分子结构、功能及其行使该功能的机制等。它是一个动态的概念。蛋白质组学是从整体角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，提示蛋白质的功能与细胞的活动规律。

近年来，蛋白质组学已逐步应用到水产及海洋动物的研究中。其中双向凝胶电泳技术是蛋白质组学研究中最基本的试验手段。凡纳滨对虾的血细胞既是细胞免疫的承担者，又是体液免疫因子的提供者，因此在免疫系统中起着重要作用，一直是研究的热点。该研究以凡纳滨对虾血细胞为研究对象，建立双向电泳图谱及技术体系，为进一步探索凡纳滨对虾的生理生化机制，进行生物质谱鉴定提供理论基础和技术保障。

1 材料与方法

1.1 主要实验仪器和材料

Milli-Q超纯水机（美国Millipore公司）；高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；PowerWave XS微孔板酶标仪(美国BioTek公司)；美国伯乐protean IEF Cell等电聚焦电泳仪，美国伯乐垂直电泳仪，冷却水循环系统；美国伯乐IPG预制胶条（线性pH值3～10，17 cm；线性pH值4～7，17 cm；线性pH值5～8，17 cm）；二硫苏糖醇(DTT)、乙二胺四乙酸(EDTA)、过硫酸铵、矿物油、碘乙酰胺(IAA)、丙烯酰胺、3-[3-(胆酰胺基丙基)二甲氨基]丙磺酸盐(CHAPS)、四甲基乙二胺(TEMED)等（Sigma公司）；其他常见试剂均为国产分析纯试剂。所用试剂均采用Milli-Q水配置。

所用凡纳滨对虾[平均体重（6～7）g]购于番禺鱼窝头养殖场。对虾购入后暂养于循环水养殖系统，环境条件为温度28℃、养殖水盐度为5‰。实验前暂养2周左右使其适应实验室养殖环境。

1.2 蛋白质样品制备及定量

取血前将凡纳滨对虾置于冰上，使其处于休眠状态，活动力下降，以便取血。以1 ml的一次性注射器由对虾第一腹节基部血窦抽取血淋巴液，所有过程均在冰上完成，所采得的血淋巴液加入等体积的抗凝剂(27 mmol/l柠檬酸钠、385 mmol/l氯化钠、115 mmol/l葡萄糖，pH值7.5)。均匀混合后立即以3 000 r/min、4℃离心10 min，舍弃上清液，所得沉淀为血细胞，分装并保存于超低温冰箱备用。

蛋白质的制备方法设2组，A组：裂解法，每份血细胞样品加入1 ml裂解液(8 mol/l尿素，2 mol/l硫脲，2%w/v CHAPS，20 mmol/l Tris-HCl，30 mmol/l DTT，2%v/v两性电解质)，用匀浆机在冰上进行裂解组织操作，每匀浆15 s停15 s以防过热，离心(4 ℃、12 000 r/min、15 min)，取上清液备用；B组：丙酮沉淀法，取A中上清250 μl，加入4倍体积10%TCA/丙酮溶液（含0.07%DTT）沉淀蛋白质，-20℃放置过夜，离心(4℃、12 000 r/min、15 min)，吸去上清液，沉淀用预冷丙酮洗3次，室温晾干。蛋白沉淀中加入500 μl裂解液，用移液器将蛋白质沉淀反复吹打直至蛋白质充分溶解。4℃、12 000 r/min、离心15 min，取上清液备用。

蛋白定量采用Bradford法，波长595 nm测定蛋白浓度，用标准牛血清白蛋白绘制标准曲线，对制备样品蛋白溶液定量。

1.3 血细胞蛋白质样品的双向电泳

1.3.1 第一向等电聚焦

将-20℃保存的胶条室温下复温10 min，分别取200、300 μg的蛋白质样品，用水化上样缓冲液(8 mol/l尿素，2 mol/l硫脲，2%w/v CHAPS，10 mmol/l DDT，0.5%v/v IPG缓冲液(pH值3～10、pH值4～7或pH值 5～8，IPG 预制胶条)，0.002%的溴酚蓝)补充至340 μl体积，混匀后加入水化盘的槽中。胶条胶面向下轻放入槽中，胶条表面加入1 ml矿物油防止样品挥发。等电聚焦程序仪器运行参数设定为30 V水化12 h，200 V线性1 h，500 V快速1 h，1 000 V快速1 h，10 000 V线性30 min，10 000 V快速直至80 000 Vh，每根胶条的极限电流50 A。

1.3.2 胶条的平衡

等电聚焦完成后，取出胶条，用滤纸吸取胶条表面多余液体，依次放入平衡液Ⅰ[50 mmol/l Tris-HCl缓冲液(pH值8.8)，6 mol/l尿素、2%SDS、30%甘油、0.002%溴酚蓝、1%DTT]和平衡液Ⅱ[50 mmol/l Tris-HCl缓冲液 (pH值8.8)、6 mol/l尿素、2%SDS、30%甘油、0.002%溴酚蓝、2.5%碘乙酰胺]中，于摇床上分别平衡15 min。

1.3.3 第二向SDS-PAGE垂直电泳

采用12.5%的SDS-PAGE电泳。将平衡后的IPG胶条移至凝胶的上方，用0.5%的琼脂糖封胶。上下槽加入电极缓冲液(Tris 5 mmol/l、Gly 192 mmol/l、SDS 0.1%)。先以120 V电泳30 min，然后240 V恒压电泳，直至溴酚蓝指示线到达凝胶底边处停止电泳，总时间约为5 h。

1.3.4 凝胶染色

电泳结束后，采用硝酸银染色法，通过固定，硝酸银染色，显影，停显及脱色，至背景清晰。

1.3.5 图像分析

凝胶通过Image scanner双向电泳凝胶专用透射扫描仪进行扫描获取高精度2-DE凝胶图像，仪器分辨率设置为300 dpi、8 bits深度，保存图像格式为tiff，一次扫描为真彩256色和灰度两种模式分别用于图谱分析。PDQuest 2-DE凝胶图像分析软件进行点检测、数目统计、凝胶匹配等处理。

2 结果

2.1 蛋白浓度测定

采用Bradford方法测定样品在595 nm处的OD值。检测标准蛋白在595 nm处的OD值，绘制成标准曲线(图 1)，得到线性方程y=0.740 5x+0.458，R2=0.996。根据此方程测得对虾血细胞蛋白浓度为3.820 4 μg/μl，据此推算双向电泳的蛋白上样量。

图1 牛血清白蛋白标准曲线

2.2 血细胞蛋白质的双向电泳

2.2.1 宽范围IPG胶条的电泳图谱

采用宽范围IPG(pH值3～10)胶条对凡纳滨对虾血细胞蛋白质的总体分布情况进行了分析(如图2)，2-DE凝胶图谱显示凡纳滨对虾的血细胞蛋白质主要分布在pH值4～8之间，中性蛋白质斑点较多，偏酸偏碱的蛋白质斑点非常少，因此在后续的实验中采用窄范围IPG(pH值4～7、pH值5～8)胶条，以提高蛋白质的分辨率。

2.2.2 窄范围IPG胶条的电泳图谱

采用窄范围IPG(pH值4～7、pH值5～8)胶条对凡纳滨对虾血细胞蛋白质的总体分布情况进行了分析(如图3)，经软件对比分析得出凡纳滨对虾的血细胞蛋白质主要分布在pH值5～8之间，因此在后续的实验中采用窄范围IPG(pH值5～8)胶条，以便利于蛋白点的分散并提高分辨率。

2.3 不同上样量的双向电泳图谱

通过对双向电泳的上样量进行摸索，结果发现，较高的上样量（300 μg）导致高丰度蛋白区域蛋白堆积情况严重（如图4），高丰度蛋白斑点过大也会影响其它蛋白斑点的分离和分析。对上样量调整至200 μg，所获图谱背景较清晰，蛋白点分辨率较高，高丰度蛋白对其它蛋白质的影响降低。因此后续实验中，均采用窄范围IPG(pH值5～8)胶条，上样量200 μg，银染。

图2 宽范围IPG胶条的血细胞蛋白质双向电泳图谱

图3 窄范围IPG胶条的血细胞蛋白质双向电泳图谱

3 讨论

3.1 蛋白质组学研究中样品制备的关键性

样品制备是蛋白质组学的关键技术。要获得高分辨率、有效性、可靠性和高重复率的双向电泳图谱，蛋白样品的制备是关键。常用的双向电泳蛋白样品制备方法有裂解法、10%TCA/丙酮沉淀法、2D Cleanup沉淀法等。10%TCA/丙酮沉淀法是非常有效的蛋白质沉淀方法，除去TCA时需要加入足够量的丙酮溶液反复清洗，这样才能制备提纯的蛋白样品，获得较理想的2-DE图谱。从双向电泳图谱结果看，10%TCA/丙酮沉淀法制备的蛋白可减少图谱中的横纹、纵纹，推测这与该方法制备的蛋白样品中去除了许多干扰物质相关。另外，10%TCA/丙酮沉淀法与2D Clean-up沉淀法等其它试剂盒提取法相比，具有成本低、操作便捷等优势。

图4 窄范围IPG胶条的血细胞蛋白质双向电泳图谱

图5 窄范围IPG胶条的血细胞蛋白质双向电泳图谱

3.2 蛋白质组学研究中胶条选择的重要性

在双向电泳实验中，选择合适pH值范围的胶条对于蛋白点的分散与筛选非常重要。根据所分离的蛋白样品，可以选择不同pH值范围的固相pH值梯度胶条。本研究首先采用pH值3～10的较宽范围的线性梯度胶条对凡纳滨对虾血细胞蛋白质进行双向电泳，得到pH值3～10范围的凡纳滨对虾血细胞蛋白质的双向电泳图谱。经图谱分析显示凡纳滨对虾血细胞蛋白大部分分布在pH值4～8之间。虽然pH值3～10的宽范围胶条能够在一张凝胶图谱上显示更多的蛋白质，但分辨率较低，可能会造成部分低丰度蛋白质的丢失，因极酸性与极碱性端蛋白质点较少，因此，后续采用窄范围IPG(pH值4～7、pH值5～8)胶条进行双向电泳实验，经软件分析双向电泳图谱得出凡纳滨对虾的血细胞蛋白主要分布在pH值5～8之间，因此在后续的实验中采用窄范围IPG(pH值5～8)胶条，以便利于蛋白点的分散并提高分辨率。

3.3 蛋白质组学研究中其他因素的影响

在双向电泳的实验流程中，等电聚焦、上样量选择等也影响实验的结果。等电聚焦关系着蛋白点的分散。一般在等电聚焦前胶条溶胀有两种方式：主动溶胀和被动溶胀。在本实验中发现采用主动溶胀，试验结果更稳定，故选用主动溶胀方式。蛋白质样品的上样量也是影响双向电泳图谱的重要环节，提高上样量，利于更多低丰度蛋白点检出，但高丰度蛋白点过大，交叉重叠，又会掩盖其它蛋白点分离。蛋白上样量太少，容易造成某些蛋白点模糊甚至缺失，选择一个合适的上样量非常重要。本研究中，针对17 cm的线性 IPG 胶条(pH值 5～8)分别进行了 300 μg与200 μg血细胞蛋白质的上样量的摸索，经过多次实验比较，发现上样量为200 μg左右，采用银染可以获得较好的双向电泳图谱。

综上所述，该研究建立的凡纳滨对虾血细胞蛋白质双向电泳体系：裂解液提取血细胞蛋白质，10%TCA/丙酮沉淀法制备蛋白质样品，采用17 cm pH值5～8的预制IPG胶条进行第一向等电聚焦，浓度为12.5%的凝胶进行第二向SDS-PAGE电泳，采用银染染色法制备凝胶图谱。采用该体系能够将凡纳滨对虾血细胞蛋白质充分分离，得到斑点清晰、分辨率高的双向电泳图谱，为凡纳滨对虾血细胞蛋白质组学研究奠定基础。