单环刺螠(Urechis unicinctus)酶解及酶解产物功能研究
2019-01-02刘春娥林宏坤
■刘春娥 林宏坤 冯 雪 刘 峰
（中国农业大学烟台研究院，山东烟台264670）
单环刺螠（Urechis unicinctus）隶属于螠虫动物门（Echiuroidea），俗称为海肠、海肠子，因营养成分与海参相似，有“裸体海参”的美誉，主要分布在我国以及日本和朝鲜沿海地区的泥滩或岩石缝中[1]。在我国，山东烟台海域产量最大，“烟台海肠”于2013年4月正式获批中华人民共和国农产品地理标志[2]。
单环刺螠体壁有较高的营养价值[1]，体壁占整体质量的32%左右，单环刺螠体壁肌中氨基酸含量占体壁肌干重的57%，粗蛋白质22.84%、粗脂肪4.24%、粗灰分2.92%[3]，含有8种人体必需氨基酸，且组成模式与人体非常相近，有谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、丙氨酸和甘氨酸5种呈味氨基酸[4-5]。
单环刺螠体腔液内有大量独特的蛋白和宽大的呼吸肠，使其获得了适应海底生存的得天独厚的条件，由此也产生了具有一定特殊功能的代谢产物，已证明单环刺螠多肽具有抗肿瘤、抗菌、免疫调节等功能[6-8]。多肽可以在一定程度上提高淋巴细胞的增殖能力和脾指数、胸腺指数[9]。从单环刺螠中分离的速激肽属于神经肽类的一种，具有抗菌功能[10-11]。
目前针对单环刺螠的研究并不多，且主要集中于天然提取多肽的功能研究，基于单环刺螠丰富的蛋白质资源，本实验通过采用不同的蛋白酶对其进行水解，以抗氧化功能、总还原力和降血糖功能为指标，探究三种酶在不同酶解时间下得到的酶解产物的功能差异，这将为单环刺螠高附加值产品的开发提供思路，进而为单环刺螠产业的发展提供基础研究。
1 材料与方法
1.1 实验材料
单环刺螠购于烟台农贸市场，活体加冰运至实验室，立即去内脏，体壁-20℃保存。
胃蛋白酶(诺维信生物技术公司，49 049 U/g)、碱性蛋白酶(郑州万博生物技术公司，577 179 U/g)、中性蛋白酶(郑州万博生物技术公司，336 859 U/g)；其他试剂均为分析纯。
1.2 实验器材
离心机(TGL-16A)、紫外分光光度计(UV-2800A)、酶标仪（Fluoroskan Ascent，Thermo Electron Corp Finland）、冻干机（FD-1PF）。
1.3 实验方法
1.3.1 酶活力测定
采用Folin-酚法[12]测定酶活力。
1.3.2 酶解液制备
将单环刺螠体壁肌解冻，沸水中隔水加热10 min，灭酶，匀浆，调至每种酶最适的温度和pH值，加酶，分别于0、0.5、1、2、3、4、5、6、7 h取酶解液，沸水浴5 min，灭酶，冻干，得多肽干粉。邻苯二甲醛法测定冻干样品的水解度[13]。
1.3.3 酶解产物的功能评价
1.3.3.1 亚铁离子螯合力测定
1 ml样品溶液加入乙醇和FeCl2溶液，震荡混匀，再加入0.2 ml菲咯嗪溶液，静置10 min，562 nm处测吸光度。
亚铁离子螯合力(%)=(空白吸光度-样品吸光度)/空白吸光度×100
1.3.3.2 DPPH自由基清除能力
样品溶液加入1.5 ml乙醇震荡混匀，再加入DPPH乙醇溶液，充分混合，避光反应60 min（室温），562 nm处测吸光度。
1.3.3.3 总还原力测定
1 ml样品溶液加入2.5 ml磷酸缓冲液和2.5 ml 5%的铁氰化钾溶液，震荡混匀，50℃反应20 min，向上述反应物中加入三氯乙酸，震荡混匀，离心，取上清液。向上清液中加入三氯化铁（0.1%），700 nm处测吸光度。
1.3.3.4 降血糖活性评价
5 mg/ml待测样品溶液加入酶标板，加入底物，37 ℃孵育10 min，加入DPP-4酶液，37 ℃ 60 min，加入100 μl醋酸-醋酸钠缓冲溶液，终止反应，405 nm测吸光度。
式中：A样品——25 μl样品+25μl底物（37 ℃孵育10 min）+50 μl DPP-4酶（37 ℃下孵育60 min）+100 μl醋酸-醋酸钠缓冲溶液；
A样品空白对照——25 μl样品+25 μl底物（37 ℃孵育10 min）+50 μl蒸馏水（37 ℃下孵育 60 min）+100 μl醋酸-醋酸钠缓冲溶液；
A阴性对照——25 μl去离子水+25 μl底物（37 ℃孵育10 min）+50 μl DPP-4酶（37 ℃下孵育60 min）+100 μl醋酸-醋酸钠缓冲溶液；
A阴性空白对照——25 μl去离子水+25 μl底物（37 ℃孵育 10 min）+50 μl去离子水（37 ℃下孵育60 min）+100 μl醋酸-醋酸钠缓冲溶液。
2 结果与讨论
2.1 三种酶在不同时间下的水解度
图1 不同酶酶解的水解度
从图1可以看出，三种酶的水解度在0～0.5 h增加较快，随后基本趋于平缓，胃蛋白酶在4 h处水解度有明显的升高，可达到38.5%。方差分析显示三种酶酶解产物的水解度没有显著差异，但酶解时间的影响差异显著（P＜0.05）。不同蛋白酶的酶活力、与底物之间的相互作用及作用位点等的不同，导致不同的酶对同一底物的酶解效果产生明显差异。胃蛋白酶主要作用于疏水性氨基酸（苯丙氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、色氨酸）；碱性蛋白酶的主要酶切位点为丙氨酸、亮氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸[13]。
2.2 酶解产物分析
2.2.1 感官评定
对三种酶的酶解产物冻干粉进行了颜色、质地以及口感方面的评价，具体结果见表1。
表1 酶解产物描述
三种酶的酶解产物不仅从颜色和质地有明显差异，口感也不相同，碱性蛋白酶和中性蛋白酶处理的肽粉有轻微的苦味，而胃蛋白酶可能因为提取时调节pH值加入的酸，导致出现明显的酸涩口感。通过酶解得到的单环刺螠多肽有一定的苦味，多肽苦味的来源主要是产生的疏水氨基酸造成的，而其明显的咸味可能因为原料自身的无机物含量高，经浓缩后盐度升高所致。
2.2.2 不同酶在不同时间酶解产物的功能评价
2.2.2.1 亚铁离子螯合力
亚铁离子螯合力主要反映多肽的抗氧化功能，实验结果如图2所示。
图2 不同酶酶解产物亚铁离子螯合力
从实验结果来看，碱性蛋白酶的亚铁离子螯合力在酶解1 h后基本稳定在35%～40%之间，中性蛋白酶酶解产物达到最大的亚铁离子螯合能力在5 h左右，可达50%。方差分析显示，两种酶的亚铁离子螯合力结果没有显著差异。胃蛋白酶的亚铁离子螯合力检测结果显示全为负值，可能与其产物pH值过低有关[14]。
2.2.2.2 DPPH自由基清除能力
DPPH自由基清除能力可以反映多肽的抗氧化能力，清除能力越强，吸光值越小，抗氧化能力越强。实验结果如图3所示。
图3 不同酶酶解产物DPPH自由基清除能力
三种酶的DPPH自由基的清除能力差异显著，胃蛋白酶＞中性蛋白酶＞碱性蛋白酶（P＜0.05）。胃蛋白酶的酶解产物对DPPH自由基清除能力在3 h达到最高，可达51.1%。与图1对照看，胃蛋白酶水解4 h时水解度最高，然而其清除DPPH能力在3 h达到最高，这也就是说并不是水解度越高，分子量越小，清除能力越强。自由基清除能力与水解液中多肽的氨基酸组成、数量以及排列顺序都有很大关系。
2.2.2.3 总还原力检测
总还原力的大小可直接通过吸光值的大小反映，吸光值越大，总还原能力越强，实验结果如图4所示。
实验结果表明，三种酶的总还原力在1 h左右基本达到较高水平，胃蛋白酶的总还原能力最强，显著高于其他两种酶（P＜0.05），在4 h时的酶解产物总还原力达到最高水平，中性蛋白酶和碱性蛋白酶的酶解产物总还原力基本保持在相同水平。该结果与尤娟对鲢鱼鱼肉蛋白抗氧化肽功能特性的研究结果基本一致[15]。胡晓等[16]分别采用六种蛋白酶对罗非鱼皮进行水解，其还原力在0.3～0.89。
图4 不同酶酶解产物总还原力检测
亚铁离子螯合力、DPPH自由基清除能力以及总还原力均属于酶解产物抗氧化能力的评价指标，从图2～4可以看出各指标的结果并不完全一致，导致这一结果的原因可能是不同方法的机理不同以及酶解产物抗氧化体系的复杂性[17]。总体而言，胃蛋白酶酶解产物的抗氧化性较强。
2.2.2.4 降血糖功能检测
从图5可以看出，胃蛋白酶在2 h酶解产物的降血糖功能达到最高水平，抑制率达到41.3%，随后保持稳定；中性蛋白酶酶解产物的降血糖功能随时间变化波动较大，在3 h达到最高。三种酶中胃蛋白酶酶解产物降血糖功能显著高于其他两种酶，而中性酶和碱性酶产物降血糖功能没有显著差异。这一实验结果与酶解鲢鱼蛋白的降血糖功能研究结果稍有不同，其结果为中性蛋白酶解产物降血糖功能最强[18]，这一差异可能与实验原料的氨基酸组成有关。
图5 不同酶酶解产物降血糖功能检测
3 结论
采用酸性、中性和碱性三种蛋白酶对单环刺螠体壁进行酶解，不同的酶得到的酶解产物的水解度没有显著差异，而水解时间对酶解效果有显著影响。对酶解所得酶解液功能进行评价，胃蛋白酶酶解产物在DPPH自由基清除能力、总还原力、降血糖功能方面均明显高于其他两种酶的酶解产物，因此，胃蛋白酶更适于单环刺螠体壁的酶解。酶解产物较理想的抗氧化及降血糖功能，为单环刺螠多肽产品的开发奠定基础。
