和厚朴酚对乳腺癌4T1细胞小鼠肺转移模型的影响

曾 敏

癌症因其高致死率，一直以来严重威胁着人类健康，传统手术切除治疗方法很难根治，随后采取的放化疗手段又给患者带来巨大痛苦和经济负担。目前，乳腺癌患者大多接受切除手术和化疗结合的治疗方案，能够取得一定的预期疗效[8]。但是，一旦发现乳腺癌细胞转移，尤其是肺转移后，传统的治疗方案效果欠佳，病死率很高。因此，寻找新的靶向低毒的抗转移药物已成为治疗晚期乳腺癌转移的研究热点之一。和厚朴酚（honokiol）是从木兰科植物厚朴中提取分离得到，具有较好的抗炎、抗菌、抗衰老和抑制肿瘤生长等作用[9]。因其为天然植物提取成分，相对合成化合物具有低毒、安全的优点，也越来越受人们关注。本课题组在体外研究中发现，其对多种肿瘤细胞具有较好的抑制作用。为此，本研究通过建立小鼠4T1肺转移模型，以考察其对乳腺癌晚期肺转移模型的治疗效果。

1 材料与方法

1.1 材料 和厚朴酚（由本课题组分离提取，经HPLC检测含量＞98%）；紫杉醇（四川太极制药有限公司）；4T1、B16F10、H460、H1975 细胞株（美国 ATCC细胞库，由本课题组保种）；RPMI-1640培养基、DMEM培养基、0.25%胰酶消化液、青霉素、链霉素（美国Hyclone公司）；胎牛血清（草原绿野生物制品有限公司）；MTT（美国 Sigma 公司）；Cleaved-Caspase3（美国 abcam 公司）；Balb/c小鼠，SPF 级， 雌性，18～20 g（北京华阜康生物科技股份有限公司），实验动物生产许可证编号：SCXK（京）2014-0004。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 4T1、H460、H1975细胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养，B16F10细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养，48 h传代一次。待细胞长至80%融合时，用0.25%胰酶消化液消化，取对数生长期的细胞用于后续实验。

1.2.2 细胞半抑制率（IC50）测定 分别取4T1、B16F10、H460、H1975细胞悬液，按 3×104个/ml细胞密度铺96孔板，每孔 100 μl，正常培养 24 h。实验分为空白对照组和和厚朴酚给药组：给药组加入终浓度为0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 μM/L 的和厚朴酚， 空白对照组加入相同体积的培养基。分别培养24、48、72 h后，用MTT法测定细胞存活率。实验结果重复3次。用Graph Pad Prism6.0软件计算IC50，考察不同时间点和厚朴酚对细胞的抑制作用（n=6）。

1.2.3 Cleaved-Caspase3蛋白表达测定 取4T1细胞悬液，按3×105个/ml细胞密度铺6孔板，每孔2 ml，正常培养24 h。实验分为空白对照组、溶剂对照组、阳性药组和和厚朴酚给药组：阳性药组给予紫杉醇10 nM/L；和厚朴酚给药组给予不同浓度和厚朴酚（0.4、0.8、1.6 μM/L）；溶剂对照组给予同体积的空白溶剂；空白对照组不做处理。作用48 h后，提取总蛋白，用BCA试剂盒测定细胞的蛋白浓度。采用免疫印迹法（Wetern blotting）检测 Cleaved-Caspase3蛋白[3-4]的表达水平[1-2]。实验步骤：每组取25 μg蛋白样品上样，进行SDS-PAGE电泳、转膜、封闭，一抗4℃孵育（1∶1000）过夜，用 TBST 洗膜 2 次；换二抗（1∶2000）室温孵育2 h，用TBST洗膜2次后，用化学发光显色试剂显影并采集图像进行分析，实验采用GAPDH为内参。

1.2.4 肺转移模型建立 取4T1细胞悬液，调整细胞浓度至 2.5×105个/ml。 按 100 μl/鼠尾静脉接种[5]，次日开始分组给药。实验分为空白对照组和和厚朴酚给药组，每组10只小鼠：空白对照组给予生理盐水200 μl灌胃，1次/d；和厚朴酚给药组给予和厚朴酚溶液 200 μl（200 mg/kg）灌胃，1 次/d。 每日观察小鼠状态，并记录生存结果。

1.3 统计学方法 应用SPSS17.0统计软件分析，计量资料以±s表示，组间比较采用One-way ANOA方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IC50测定结果 和厚朴酚对各肿瘤细胞增殖均有明显抑制作用，且随作用时间延长IC50也随之降低（P＜ 0.05，表 1）。

表1 和厚朴酚对细胞增殖的影响(n=6)

2.2 和厚朴酚对4T1细胞Cleaved-Caspase3蛋白表达的影响 与空白对照组比较，0.4、0.8、1.6 μM/L的和厚朴酚作用48 h，能明显增加细胞Cleaved-Caspase3蛋白的表达，且强于阳性药紫杉醇组，而溶剂对照组Cleaved-Caspase3蛋白表达量没有明显变化。见图1。

图1 各组4T1细胞Cleaved-Caspase3表达结果比较

2.3 生存率考察结果 在接种4T1细胞后，空白对照组在接种第10 d时便开始有小鼠死亡，且在第14 d后小鼠开始死亡增多，第18 d时已无小鼠存活。与空白对照组比较，和厚朴酚给药组在接种第24 d时才有1只小鼠死亡，第40 d后小鼠开始陆续死亡，中位生存期为58 d（图2）。

图2 和厚朴酚对乳腺癌4T1细胞肺转移模型小鼠生存率的影响

3 讨论

近年来，中药活性成分用于抗肿瘤的研究日益增多，因其低毒、经济的优势而广受青睐。和厚朴酚作为常用中药厚朴的有效成分，其来源较广，获得相对容易，且药理作用面较广，具体的作用机制仍有待进一步研究。由本研究结果（表1）可以看出，和厚朴酚对几株肿瘤细胞的IC50均小于30 μM/L（72 h），表现出良好的抑制效果。表明和厚朴酚对肿瘤细胞增殖有明显抑制作用，且对人源（H460、H1975）和鼠源（4T1、B16F10）细胞珠均有较好抑制作用，并存在一定的时间依赖关系。免疫印迹结果（图1）也表明，和厚朴酚对凋亡促进相关蛋白Cleaved-Caspase3的表达有明显上调作用，提示其能有效诱导肿瘤细胞发生凋亡[7]。

在癌症发展过程中，晚期患者常会出现肿瘤细胞转移的情况，从而导致病情进一步恶化，给患者和治疗带来严峻挑战。本研究通过尾静脉接种乳腺癌4T1细胞，入血后会自发转移至肺部，来模拟乳腺癌晚期肺转移情况[10]。结果接种后，未经药物治疗的小鼠会很快死亡（空白对照组小鼠中位生存期仅为18 d），解剖后可发现小鼠肺部有大量4T1细胞聚集。给药组通过200 mg/kg剂量的和厚朴酚干预治疗，与空白对照组比较，小鼠开始出现死亡和无小鼠存活时间明显延长，中位生存期达58 d，表明和厚朴酚对小鼠肺转移模型有较好的治疗效果。

综上所述，和厚朴酚能有效抑制肿瘤细胞增殖，对肿瘤细胞转移和生长有较好抑制作用，具有较大的开发利用价值。