超声波催陈新醋的工艺研究

张媛渊，王如福，郎繁繁，侯红萍*

（1.山西农业大学 食品科学与工程学院，山西 太谷 030801；2.山西紫林醋业股份有限公司，山西 太原 030400）

醋，在中国作为各菜系中的酸性调味品受到广大消费者的欢迎。以老陈醋为基质的保健醋有降低甘油三酯、软化血管、降血脂、调节血糖等独特功效[1]，除此之外，食醋中含有黄酮类、多酚类、蛋白黑素等多种抗氧化活性成分，可以有效地清除氧自由基抵抗机体的氧化应激[2]。山西老陈醋是我国四大名醋之一，已有三千多年的历史，具有色泽黑紫、醋液清澈、气味清香、食之绵酸、醇厚不涩等特点，它含有丰富的糖类、维生素、矿物质和盐等多种营养物质。传统的山西老陈醋经过“夏日晒，冬捞冰”的方法进行陈酿，该方法有设备占地面积大，管理相对困难，环境不理想等缺陷。因此，食醋的人工催陈技术[3-5]受到人们的青睐。人工催陈技术主要有超声波催陈[6-8]、超高压技术催陈[9]、化学法[5]和生物催陈技术[10-12]等。目前常用的催陈技术是超声波催陈技术，即当超声波频率＞20 kHz时，可使介质进入振动状态，产生空化效应促进介质中极性分子的整齐排列及低分子化合物的聚合与缩合反应，加速酯化、缩合、氧化还原等反应的进行，促进缔合作用，增强水、醇、醛、酯等极性分子间的亲和力，有利于食醋中酯香物质的形成[9]。超声波频率高，波长短，方向性好，穿透力强等特点对食醋人工催陈极为有利，采用超声波技术催陈食醋加快酯类物质合成，提高醋品质，提高醋的生产效率具有实际的应用价值。刘凤叶[13]采用超声波生物生长促进仪对镇江香醋进行催陈，处理后的香醋中氨基酸、乙酸和醇类物质含量减少，减弱食醋的刺激性气味，达到食醋陈酿的效果；王振斌等[8]采用超声波对食醋进行催陈，对主成分分析表明催陈醋的指标与自然陈酿4年的香醋相近。

本研究以总酯含量为响应指标，采用响应面法对超声波催陈新醋的工艺进行了研究，并采用顶空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）和气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）联用对新醋与超声波处理后的醋中的挥发性成分进行测定、对比和分析[14-16]，在此基础上与自然陈酿5个月食醋的理化指标进行了对比，以建立最优的催陈方法，为食醋生产企业缩短陈酿时间，增加生产效益提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新酿制食醋：山西紫林醋业股份有限公司。

无水乙醇、NaOH（均为分析纯）、甲醛溶液（37%～40%）：天津市大茂化学试剂厂；领苯二甲酸氢钾、Na2CO3、氯化钾（均为分析纯）、硫酸（纯度98%）：天津市恒兴化学试剂制造有限公司；CuSO4（分析纯）：北京中联化工试剂厂；酒石酸钾钠（分析纯）：天津市风船化学试剂科技有限公司；磷酸氢二钾（分析纯）：天津市光复科技发展有限公司；葡萄糖（生化试剂）：北京奥博星生物技术有限责任公司。

1.2 仪器与设备

ST3100实验室pH计：奥豪斯仪器有限公司；B11-3恒温磁力搅拌器：上海司乐仪器有限公司；JJ124BC型电子天平：常熟市双杰测试仪器厂；GZX-GF101-3-BS-Ⅱ/H电热恒温鼓风干燥箱：上海跃进医疗器械有限公司；HHS型电热恒温水浴锅：上海博迅实业有限公司；SB-5200DTDN超声波清洗机：宁波新芝生物科技股份有限公司；50/30μm二乙烯基苯（divinylbenzene，DVB）/碳分子筛（carboxen，CAR）/聚二甲硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）萃取纤维头：美国SUPELCO公司；TraceISO气相色谱-质谱联用仪：美国Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 超声波催陈新醋工艺优化单因素试验

超声波处理时间对食醋总酯含量的影响：将100 mL新醋置于150 mL锥形瓶中，固定频率为40 kHz，添加0.5%（V/V）的无水乙醇，密闭放入超声波清洗机的水槽中央，超声波功率为180 W，温度为47℃，处理时间分别为40 min、70 min、100 min、130 min、160 min、190 min和220 min。超声波处理完成后，用流动水快速冷却至常温，分别测定食醋中总酯的含量。

在此基础上，采用单因素轮换法，依次考察乙醇添加量（0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%）、超声波功率（80W、100W、120W、140 W、160 W、180 W、200 W）和超声波处理温度（27℃、32℃、37℃、42℃、47℃、52℃、57℃）对食醋中总酯含量的影响。

1.3.2 超声波催陈新醋工艺优化响应面试验

在单因素试验的基础上，为使超声波发挥最大且稳定的效能，固定超声波的功率为180 W。根据Box-Benhnken的中心组合设计（centralcomposite design，CCD）原理，以超声波处理时间（X1）、乙醇添加量（X2）、超声波处理温度（X3）为影响因素，食醋中总酯含量（Y）为响应值进行响应面优化，试验因素与水平见表1。

表1 Box-Behnken试验因素与水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments

1.3.3 测定方法

理化指标主要包括总酸、氨基酸态氮、不挥发酸、还原糖和总酯。总酸含量参照GB/T 5009.41—2003《食醋卫生标准的分析方法》的方法进行测定；氨基酸态氮含量参照GB/T 5009.39—2003《酱油卫生标准的分析方法》的方法进行测定；不挥发酸含量参照GB/T 18187—2000《酿造食醋》的方法进行测定；还原糖和总酯含量参照GB/T 19777—2013《地理标志产品山西老陈醋》的方法进行测定。

色度[17]：以蒸馏水为对照，采用分光光度计在波长520nm处测定吸光度值，用OD520nm值表示。

感官特性：选择3名有经验人员对醋的气味与颜色进行评价。气味分为刺鼻性、温和性、酯味清淡和酯味浓郁；颜色分为褐色和深褐色。

1.3.4 食醋中香气成分的分析

固相微萃取：取5 mL醋样置于15 mL带硅胶垫的顶空样品瓶中，加入质量浓度为0.2 g/mL的氯化钠完全混匀，用硅胶垫的瓶盖密封顶空样品瓶。采用熊越等[18]方法并加以改进：放入恒温孵化箱，于40℃条件下保持20 min，SPME萃取头插入顶空瓶中，推出纤维头，且距离液面保持1 cm的距离。在萃取温度为40℃条件下萃取10 min。萃取头插入GC-MS汽化室，在250℃条件下解吸5 min，启动仪器收集数据。

气相色谱条件：TG-5MS弹性毛细管色谱柱（30 m×250 μm×0.25 μm），进样口温度 250℃，载气为氦气（He），流速1.0 mL/min，不分流进样，升温程序：柱温起始温度35℃保持5 min；以5℃/min上升至160℃，保持3 min；然后以10℃/min的速度上升至250℃，保持3 min。

质谱条件：接口温度250℃，离子源温度230℃，电离方式为电子电离（electron ionization，EI）源，电子能量70 eV，质量扫描范围为45～500 u。对照NIST/EPA/NIH 2.0版本质谱库鉴定得到的成分，用峰面积归一化法进行定量分析。

2 结果与分析

2.1 超声波催陈新醋工艺优化单因素试验

2.1.1 超声波处理时间对食醋中总酯含量的影响

超声波处理时间对食醋中总酯含量的影响结果见图1。

图1 超声处理时间对食醋中总酯含量的影响Fig.1 Effect of ultrasonic treatment time on the total ester content in vinegar

由图1可知，随着超声处理时间的增加，食醋中总酯含量呈先增加后减少的趋势，当超声波处理时间达到130 min时，食醋中的总酯含量达到最大，为12.79 g/L。分析原因可能是超声波处理食醋时，产生的超声波能量使食醋中的醇类物质与有机酸发生酯化反应，处理时间太久则可使得酯类物质易挥发或发生水解反应，造成酯类物质减少。因此，超声波处理的最佳时间为130 min。

2.1.2 乙醇添加量对食醋中总酯含量的影响

酯类物质的提升对食醋品质口感有很大影响，为了促进食醋中的酯化反应，在食醋中添加适量的无水乙醇可与食醋中的有机酸反应生成酯类物质。乙醇添加量对食醋中总酯含量的影响结果如图2所示。

图2 乙醇添加量对食醋中总酯含量的影响Fig.2 Effect of ethanol addition on the total ester content in vinegar

由图2可知，乙醇添加量为0.2%～0.6%时，食醋中总酯含量增加的相对较快（P＜0.05），由10.94 g/L增加至13.31 g/L。随着乙醇添加量的增加，食醋中的酯类物质明显增多；当乙醇添加量＞0.6%之后，食醋中的总酯含量趋于平稳并不再增加，达到13.33 g/L。因此，乙醇最佳添加量为0.6%。

2.1.3 超声波功率对食醋中总酯含量的影响

超声波功率对食醋中总酯含量的影响结果如图3所示。

图3 超声波功率对食醋中总酯含量的影响Fig.3 Effect of ultrasonic power on the total ester content in vinegar

由图3可知，随着超声波功率在80～200 W范围内的增大，食醋中的总酯含量不断上升并趋于平稳，当功率达到180 W时，食醋中的总酯含量达到最大值，为12.88 g/L，说明超声波功率在一定范围内可以促进食醋的酯化反应。因此，超声波处理的最佳功率为180 W。

2.1.4 超声波处理温度对食醋中总酯含量的影响

超声波处理温度对食醋中总酯含量的影响结果如图4所示。

图4 超声波处理温度对食醋中总酯含量的影响Fig.4 Effect of ultrasonic treatment temperature on the total ester content in vinegar

由图4可知，处理温度为27～42℃时，食醋中的总酯含量呈上升趋势；当处理温度为42℃时，食醋中总酯含量达到最高，为12.34 g/L；当处理温度＞42℃之后，食醋中总酯含量明显下降，分析原因可能是由于处理温度过高造成酯类物质的挥发或者水解，使得食醋品质下降。因此，超声波最佳处理温度为42℃。

2.2 超声波催陈新醋工艺优化的响应面试验结果

2.2.1 Box-Behnken试验设计及试验结果

Box-Behnken试验设计及结果见表2，方差分析结果见表3。

表2 Box-Behnken试验设计及结果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments

表3 回归模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

根据响应面试验结果得出，超声波催陈新醋的总酯含量（Y）与超声波处理时间（X1）、乙醇添加量（X2）、超声波处理温度（X3）3因素的多元线性回归模型方程为Y=13.71+0.19X1+0.16X2-0.099X3-0.040X1X2-0.10X1X3+0.005X2X3-0.82X12-

由表3可知，模型的P＜0.000 1，模型极显著，表明试验设计可靠；失拟项P=0.076 0＞0.05，影响不显著，表明回归方程拟合度较好，可反映3个因素与响应值间的真实关系；模型的回归决定系数R2=0.9931，表明响应值的变化有99.31%来源于所选因素的变化，该模型可以用于预测超声波催陈新醋工艺的优化程度。回归方差及各项方差结果表明，3个因素对食醋中总酯含量的影响主次顺序为X1＞X2＞X3，即超声波处理时间＞乙醇添加量＞超声波处理温度。另外，一次项X1、X2和X3对Y影响极显著（P＜0.01），且X1和X2一次项系数为正，均为正效应；交互项X1X3对Y影响显著（P＜0.05）、X1X2和X2X3对Y影响不显著（P＞0.05）；二次项对Y影响极显著（P＜0.01）。结果表明，各因素对食醋中总酯含量的影响不是简单的线性关系。

由Design Expert 8.0.6.1得出超声波催陈新醋理论最优工艺条件：超声波处理时间为137.37 min，乙醇添加量为0.63%、超声波处理温度为40.02℃，其预测的总酯含量为13.75g/L。为了便于实际操作，将最优工艺条件修订为：超声波处理时间137min、乙醇添加量0.65%、超声波处理温度40℃。

2.2.2 超声波催陈新醋工艺的响应面分析及等高线

超声波处理时间、乙醇添加量、超声波处理温度交互作用对食醋中总酯含量影响的响应面曲线及等高线见图5。

图5 超声波处理时间、乙醇添加量及超声波处理温度交互作用对食醋中总酯含量影响的响应面曲线及等高线Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between ultrasonic treatment time,ethanol addition and ultrasonic treatment temperature on the total ester content in vinegar

由图5可知，任何2个交互作用的响应面都存在最高点，可直观得到各因素的最优水平及其相互作用。且X1X3的交互作用对总酯含量的影响相对于X1X2和X2X3较显著。

2.2.3 验证试验

为验证上述结果的可靠性，在此最优条件下对新醋进行超声波处理，做3次平行试验，得到的食醋中实际总酯含量为（13.745 6±0.048）g/L，与预测值（13.75 g/L）一致，故得到的模型能够较好预测实际超声波处理食醋的条件及总酯含量，具有可靠的现实意义。

2.3 超声波催陈新醋对食醋理化指标及感官特性的影响

超声波催陈后的新醋与未处理的新醋理化指标及某些感官的比较结果见表4。

表4 超声波催陈前后新醋理化指标及感官特性的比较Table 4 Comparison of physicochemical indexes and sensory characteristics of original vinegar before and after accelerated aging by ultrasonic g/100 mL

由表4可知，较新酿制食醋，经超声波处理的食醋，其总酯含量（1.38 g/100 mL）提高50%，相当于新醋经5个月自然陈酿后的总酯含量（1.29 g/100 mL）；总酸含量（3.98 g/100 mL）减少；氨基酸含量（0.19 g/100 mL）及还原糖含量（0.35 g/100 mL）均显著降低（P＜0.05），因其在陈酿或人工催陈过程中发生美拉德反应，加深醋的色泽，故而有所减少。从口感品质方面来讲，新酿制食醋醋味刺鼻，酯香味清淡，而经超声处理的食醋或经自然陈酿的食醋，其口感良好，醋香温和不刺鼻，酯香味较浓郁。

2.4 食醋中挥发性香气成分的测定结果

采用顶空固相微萃取和气质联用的方法从新醋与超声波催陈新醋中共检测出100种物质，按照所需挥发性成分，删减掉未知与其他相对含量极少的化合物，从中筛选出46种香气成分，结果见表5。

由表5可知，挥发性香气成分的种类有酸类、醇类、酯类、酚类、醛类、呋喃、吡嗪等特征性香气成分，新醋与超声波催陈新醋的酸、醇、酯、酚、醛和其他特征香气的相对含量依次为15.66%和11.77%、12.11%和11.84%、8.5%和9.34%、1.4%和1.64%、18.07%和16.52%、1.93%和1.81%；自然陈酿5个月食醋的酸、醇、酯、酚、醛和其他特征香气的相对含量（13.75%、11.68%、9.19%、1.44%、16.28%和1.96%）与超声波催陈新醋大致相当。

表5 食醋中挥发性香气成分检测结果Table 5 Determination results of volatile aroma components in vinegar

续表

经超声波催陈新醋后食醋中酸类与醇类物质（不含添加的无水乙醇）的相对含量明显减少，而酯类的相对含量增加，是因为酸类与醇类物质发生了酯化反应，其中乙酸、异戊酸、2-甲基丁酸、α-酮戊二酸的相对含量分别减少了32.97%、14.29%、13.79%、13.79%。醇类中1,3-丁二醇、2,3-丁二醇、2-呋喃甲醇、苯乙醇的相对含量分别减少了18.39%、7.22%、13.79%、2.57%。酸类物质的减少对改善食醋风味有一定作用。酯类中乙酸乙酯、甲氧基乙酸乙酯、丁二酸二乙酯、苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯的相对含量增加了49.65%、1.26%、3.92%、28%、4.67%。各酯类物质的增加提高了食醋的特征香气，与其他香气成分共同协调，对维持食醋特的风味有很大作用[18]，香气物质的种类与含量的差异决定了不同食醋的特殊风味。除此之外，2,3,5,6-四甲基吡嗪的相对含量也增加了5.38%，四甲基吡嗪类化合物具有甜的巧克力、可可、咖啡的香气，对食醋的特征风味有重要影响[19]。

3 结论

采用超声波催陈技术对新醋进行催陈，以食醋中总酯含量为响应值，通过响应面法优化得到超声波催陈新醋的最优工艺条件：超声波处理时间为137 min、乙醇添加量为0.65%、超声波处理温度为40℃、超声波功率为180 W。在最优工艺条件下，食醋中总酯含量达到13.75 g/L，比未处理食醋的总酯含量提高了50%，与自然陈酿5个月左右食醋的总酯含量相近；较未处理食醋，总酸、氨基酸态氮及还原糖含量均降低，其色泽棕红、口感良好、醋香温和不刺鼻，酯香味较浓郁，为改善传统食醋的陈酿方法提供了理论依据。

采用HS-SPME和GC-MS联用的方法从新醋与超声波催陈新醋后的食醋中共筛选得出46种主要成分，包括酸（9种）、醇（8种）、酯（11种）、醛（7种）、酚（5种）及其他（6种）。新醋经超声波催陈后，总酸的相对含量减少了24.84%，酯类物质相对含量增加了9.88%，2,3,5,6-四甲基吡嗪的相对含量也增加了5.38%。