永康高山绿茶超高效液相色谱指纹图谱研究

杨 璐，支红峰，胡中豪

（永康市食品药品检验检测中心，浙江永康321300）

永康地处浙江省中部，拥有较多山地和丘陵，气候温和，四季分明，利于茶叶生长种植。目前，永康拥有大寒山、毛虎山等生产基地，茶园总面积超过500亩，2018年茶叶总产量约14.5 t。凭借良好的地理优势与生态环境，经过多年的开发与研制，已经拥有“寒峰有机绿茶”、“永康红”等知名产品。由于受气候、环境、加工工艺等因素的影响，茶叶品质会出现一定的差异。

指纹图谱分析作为目前一种成熟的分析技术，可对已知和未知的成分做出全面的表征，适用于中药及中药制剂真伪鉴别、质量控制以及新产品开发等[1-3]，近年来也逐渐在茶叶品质控制上得到应用[4-11]。通过对茶叶品质做出可量化的评价，可以有效弥补“感官评价”存在的带有较强主观性、缺乏科学实验研究基础，且评价结果易受环境条件、设备条件、品评方法等因素影响的缺陷，是一种更科学、有效的控制及评价茶叶品质的方法。其中，色谱法应用最为广泛，发展迅猛[12]。超高效液相色谱（ultra performance liquid chromatography，UPLC）由于其灵敏度高、分离效果好等特点，相较于普通液相色谱更有优势[13-14]。

关于永康高山绿茶指纹图谱的研究尚未见报道，本研究利用超高效液相色谱法初步构建了永康高山绿茶UPLC指纹图谱，以期为品质控制提供客观依据，同时也为后期的良种选育提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

绿茶样品1#、2#、8#产自永康毛虎山，3#～7#、9#～10#、14#～15#产自永康大寒山、16#产自永康盘龙谷；11#～13#来自安徽芜湖，分别为碧螺春茶和2个炒青茶。

茶氨酸（theanine，T）（99%）、没食子酸（gallic acid，GA）（99.9%）、可可碱（theobromine，TB）（99.9%）、咖啡因（caffeine，CAF）（500 mg/L）、没食子儿茶素（gallocatechin，GC）（98.1%）、表没食子儿茶素（epigallocatechin，EGC）（99.4%）、儿茶素（catechin，C）（99.3%）、表没食子儿茶素没食子酸酯（epicatechin gallate，EGCG）（99%）、表儿茶素（epicatechin，EC）（96.7%）、表儿茶素没食子酸酯（epicatechin gallate，ECG）（98.1%）、三氟乙酸（色谱纯）：上海安谱实验科技股份有限公司。

甲醇（色谱纯）：美国Tedia公司；无水乙醇（色谱纯）：天津赛孚瑞科技有限公司。

1.2 仪器与设备

WatersUPLCI-class超 高效液相色谱仪（配二极管阵列检测器）：美国Waters公司；SHZ-B水浴恒温振荡器：上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；Allefra 64R台式高速冷冻离心机：美国贝克曼库尔特公司；BSA 822电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

茶叶样品粉碎后取0.20 g，加入20 mL体积分数20%的乙醇水溶液，涡旋混合均匀，于水浴恒温振荡器中70℃、200 r/min提取20 min，冷却至室温，10 000 r/min离心10 min，取上清液，用水定容至25 mL，溶液经0.22 μm滤膜过滤后上机分析。

分别称取茶氨酸、没食子酸、可可碱、咖啡因、没食子儿茶素、表没食子儿茶素、儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素、表儿茶素没食子酸酯适量标准品，用无水乙醇配制成质量浓度为1.00 mg/mL储备液备用。

1.3.2 色谱条件

岛津Shim-pack XR-ODSⅡ色谱柱（2.0 mm×150 mm，2.2 μm）；流速0.2 mL/min；柱温30℃；流动相A为0.05%三氟乙酸水溶液，B为甲醇，梯度洗脱程序见表1；检测波长0～3 min为203 nm，3～9 min为280 nm。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Program of gradient elution

1.3.3 方法学考察

取同一绿茶样品，按1.3.1制备，取同一样品提取液6份，在1.3.2的色谱条件下分析，计算峰面积相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），考察方法的精密度；取同一样品提取溶液分别于0、4 h、8 h、16 h、24 h测定，计算RSD值，考察方法的稳定性。在绿茶样品中分别添加3份浓度不等的标准混合液，测定各目标成分的回收率。

1.3.4 数据分析

利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004 A版）软件对数据进行分析，生成共有模式，进行相似度评价。使用SPSS 22.0软件对样品进行聚类分析和判别分析。

2 结果与分析

2.1 UPLC方法学考察

方法的精密度和稳定性试验结果见表2，加标回收试验结果见表3。结果表明，在精密度实验中，UPLC图谱中的各个共有峰的保留时间和峰面积的相对标准偏差分别小于0.06%和3.4%，方法精密度良好；在稳定性实验中，24 h内，各共有峰的保留时间和峰面积的RSD值分别小于0.8%和5.0%，说明该方法制备的绿茶提取液在24 h内基本稳定。加标回收实验中，茶氨酸等10种组分3水平的平均加标回收率在89.2%～110.4%范围内，其RSD值在0.9%～3.9%之间，符合检测方法对回收率的要求。

表2 精密度与稳定性试验结果Table 2 Results of precision and stability tests

表3 10种成分的加标回收率试验结果Table 3 Results of adding standard recoveries tests of 10 components

2.2 UPLC指纹图谱构建

在同一色谱条件下对13批次样品进行测试，所得色谱图数据经中药色谱指纹图谱相似度评价系统分析，得到13个绿茶样品的指纹图谱（图1）和共有模式（图2）。

选择相对稳定、出峰时间适中且峰面积较大的15号色谱峰为参照峰，分别计算各样品中其余组分峰的相对保留时间以及相对峰面积。各组分峰按相对保留时间一一匹配后共得到18个共有峰。但有研究发现在出峰密集的情况下，仅用相对保留时间作为定性，结果并不完全可靠，需要进一步验证[15-16]。利用二极管阵列检测器对各色谱峰进行光谱扫描（190～400 nm）可作为共有峰的辅助识别。将各样品中的18个共有峰最大吸收波长两两进行比较，其中8、13、15号色谱峰的最大吸收波长稍有差异（＜10 nm），但其全波长扫描图谱形状基本一致，可认为是同一种物质。其余15个共有峰之间的差异均＜5 nm。因此，通过光谱分析验证13个永康绿茶样品指纹图谱中共有18个共有峰，其最大吸收波长和相对保留时间见表4。

图1 13个永康绿茶样品的UPLC指纹图谱Fig.1 UPLC fingerprint of 13 Yongkang green tea samples

图2 永康绿茶UPLC指纹图谱共有模式Fig.2 Common pattern of UPLC fingerprint of Yongkang green tea

表4 13个绿茶样品共有峰的最大吸收波长和相对保留时间Table 4 Maximum absorption wavelength and relative retention time of common peaks of 13 Yongkang green tea samples

经与标准品比较，确定了9个峰的组分：峰3为茶氨酸，峰8为没食子酸，峰9为没食子儿茶素，峰11为可可碱，峰14为表没食子儿茶素，峰15为表没食子儿茶素没食子酸酯，峰16为咖啡因，峰17为表儿茶素，峰18为表儿茶素没食子酸酯。且各色谱峰与其对应的标准品峰最大吸收波长一致。18个共有峰面积占总峰面积比例约为95%，基本涵盖了绿茶内在的化学信息。

2.3 相似度评价

经中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版）软件计算，13个永康本地绿茶样品与其共有模式的相似度分别为0.990、0.988、0.990、0.990、0.988、0.996、0.992、0.988、0.985、0.989、0.994、0.988、0.984，相似度均＞0.98，符合指纹图谱的要求，说明永康本土绿茶化学成分相似、质量稳定。

2.4 不同产地绿茶的聚类分析和判别分析

数据采用欧式最短距离法对不同产地的绿茶进行聚类分析，结果见图3。由图3可知，当临界值为5时，16个茶树样品可以分为2大类。其中，来自永康本地的聚成一类，安徽芜湖的3个样品聚成一类。来自安徽的碧螺春茶和炒青茶的加工工艺与永康本地高山绿茶加工工艺相似，主要经过杀青、揉捻、干燥三个步骤，聚类分析结果表明，永康本地高山绿茶与来自安徽芜湖的绿茶样品内在化学成分存在一定差异，可用聚类分析手段进行初步筛分。

图3 不同产地绿茶的聚类分析结果Fig.3 Cluster analysis results of green tea samples from different regions

本实验分为两分类典则判别，Wilkλ值为0.001，卡方为48.811，P值为0.000，判别函数具有统计学意义。根据Fisher判别函数得到两类样品的校正集判别与聚类分析结果完全一致，省外3个绿茶样品判为一类，其余13个永康绿茶样品判为一类。整体判别模型稳定，同时也进一步确认了聚类分析的可靠性。

3 结论

本试验采用UPLC指纹图谱分析手段得到了永康高山绿茶内在化学成分的综合信息，并通过保留时间定性和光谱扫描等方式确定了18个共有峰，同时确定了响应值最高的9个峰的成分。该图谱可有效反映永康高山绿茶内在成分的相似性。通过聚类分析和判别分析进一步证实该指纹图谱的稳定性与专一性，可作为永康高山绿茶质量控制与评价的重要依据。此外，绿茶品质易受产地环境、加工工艺等多个因素的影响，后续研究可参考本试验建立的指纹图谱，结合质谱等仪器方法完善指纹图谱信息，并将永康高山绿茶做进一步甄别研究与选育研究。