肾衰方及其拆方对MMP7、α-SMA调节作用的探讨

沈金峰，黄伟，晏子友

(江西中医药大学，江西 南昌 330006)

肾间质纤维化是各种肾脏疾病进展到终末肾衰的共同转归，是肾功能衰竭的主要病理表现。延缓肾脏疾病进展的主要方法是改善肾间质纤维化的病理变化。本研究采用单侧输尿管梗阻(Unilateral ureteral obstruction,UUO)诱导肾间质纤维化小鼠模型，观察了肾衰方对MMP7、α-SMA表达的作用及其抗肾间质纤维化的机制，现报告如下。

1 材料和方法

1.1 动物分组与造模

SPF级雌性大鼠72只(购于浙江省医学科学院实验动物中心提供，合格证号：SCSK(浙)20170001 )，体质量180～200 g，适应1周，尿蛋白阴性者方可使用。按体重随机分为假手术组、模型组、肾衰方组、补虚方组、袪邪方组、贝那普利组，每组12只。UUO动物模型参照文献[1]方法进行，即以5.0%水合氯醛(10 mL/kg体质量)腹腔注射麻醉后，于左侧中腹部切开皮肤，游离左侧输尿管，分别在肾盂处和输尿管上1/3处用丝线结扎后，切断输尿管，逐层缝合皮肤即可。假手术组仅游离左侧输尿管，不结扎及切断输尿管。

1.2 药物与试剂

肾衰方组(生黄芪30 g，生地黄10 g，党参15 g，山萸肉10 g，淮山药15 g，丹参20 g，泽泻10 g，土茯苓20 g，白花蛇舌草20 g，六月雪20 g，生大黄后下10 g，淫羊藿15 g,共12味中药)、补虚方组(生黄芪30 g，党参15 g，生地黄10 g，山萸肉10 g，山药15 g，淫羊藿15 g,共7味中药)、袪邪方组(生大黄10 g，丹参20 g，白花蛇舌草20 g，六月雪20 g，土茯苓20 g，泽泻10 g,共6 味中药)三组，所有中药均由江西中医药大学中药饮片厂专家鉴定后提供，常规方法水煎，分别浓缩成每毫升含生药量1.2 g、0.4 g、0.8 g三种剂量，4℃冰箱保存。由江西中医药大学附属医院药剂科制备。盐酸贝那普利(商品名：洛丁新)由北京诺华制药有限公司提供,规格10 mg/片，批号：H2003014。

兔抗大鼠MMP7单抗、兔抗大鼠α-SMA单抗均由武汉博士德生物工程有限公司提供，以1∶100稀释。Masson染色试剂盒、DAB显色试剂盒、免疫组化超敏SP试剂盒由福州迈新生物技术开发有限公司提供；磷酸缓冲液(PBS)由柠檬酸缓冲液由北京中杉金桥生物技术有限公司提供。

1.3 给药方法

手术后第3天，各中药组及贝那普利大鼠给药均按10倍于临床用药剂量折算为等效剂量给药，即肾衰方组、补虚方组和祛邪方组大鼠分别按分别按1.95 g/mL、0.95 g/mL、1.00 g/mL肾衰方浓缩剂给药，即给药剂分别为19.5 g/kg·d、9.5 g/kg·d、10.0 g/kg·d灌胃(均相当于成人剂的10倍)；予贝那普利组大鼠贝那普利1.5 mg/kg·d灌胃(相当于成人剂量的10倍)，假手术组和模型组大鼠给等量生理盐水灌胃。各组大鼠分别于手术后第7天、第14天处死。

1.4 观察与检测方法

1.4.1 一般情况观察

观察各组大鼠饮食、体质量、计算左肾(术侧)湿重、肾脏器系数(肾湿重/体质量×100%)；

1.4.2 肾组织学检查

大鼠处死后，迅速取出术侧肾脏，称重。肾组织经4%福尔马林液浸泡固定，脱水，石蜡包埋，制成约4 μm 厚切片，做HE及Masson染色，光镜下观察肾脏组织学变化。每组随机取1只大鼠，活体取术侧肾髓质一小块(0.5 mm3)新鲜组织经2.5%戊二醛固定、1%锇酸后固定，Epon812包埋，醋酸铀-枸椽酸铅双染色，H-600型透射电镜下观察。

1.4.3 肾小管损伤程度评分及肾小管间质纤维化指数测定

HE染色评定[2]：光学显微镜观察(×400 倍)，依据每个视野肾小管病变(肾小管上皮细胞空泡变性、肾小管扩张、肾小管萎缩、红细胞管型、蛋白管型、间质水肿、间质纤维化、间质炎性细胞浸润等)累及的小管数目评定肾小管间质损伤指数损伤按 Banff分级进行0～3级半定量计分。0分：肾小管结构正常，未见病变；1分：肾小管病变数目<3个；2分：肾小管病变数目3～5个；3分：肾小管病变数目>5个或肾小管结构消失。每张切片随机选取 10个视野不相重叠的皮质处肾小管，每只大鼠选5张组织切片，最后取平均值。Masson染色半定量分析[3]：在400倍视野下，每只大鼠选取5张组织切片，每张切片随机选取5个互不重叠的肾皮质处肾小管间质视野，取平均值。根据视野中胶原染色阳性面积占整个视野面积的百分比评定肾间质纤维化指数，标准如下：0分，纤维化阳性面积<2%；1分，纤维化阳性面积2%～10%；2分，纤维化阳性面积 11%～20%；3分，纤维化阳性面积 21%～30%；4分，纤维化阳性面积>30%。

1.4.4 免疫组化检测

用SP法检测实验大鼠肾间质MMP7、α-SMA的蛋白表达。每组取8只大鼠的术侧肾脏，严格按SP试剂盒说明进行免疫组化技术操作，用PBS代替一抗作阴性对照，DAB显色，苏木素复染。免疫组化结果借助用Image-Pro Plus 5.0图像分析软件进行计算机图象分析。每张切片随机选取5个高倍视野(×400)，对所选视野内的免疫组化阳性信号经计算机图像分析，通过积分吸光度值反映蛋白表达的高低。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 一般观察及病理检查

外观性观察：模型组大鼠的皮毛松软、灰暗，消瘦，厌食，少动。治疗组大鼠的饮食、体质量、存活率、活动情况无显著差异，但整体状况均比模型组稍好。

肉眼观察：假手术组大鼠肾脏表面光滑，颜色鲜红，质脆柔软。术后第7天、第14天无明显变化；UUO大鼠造模术侧肾脏体积大于对侧，颜色变淡，剖面表现出缺血状，肾皮质为尤为明显。肾盂、肾盏扩张明显，内含尿液，肾实质变薄，皮髓质边界模糊不清。术后第7天变化不明显，术后第14天出现明显变化。模型组及各治疗组大鼠术侧肾脏颜色苍白，有的可见一层薄萎缩样纤维化肾组织，内有大量积水，乳头呈空洞状，肾湿重较假手术组减轻。非术侧大鼠肾脏术后第7天、第14天较假手术组变化不明显。各治疗组大鼠肾脏在色泽、大小、质地、积水程度方面都较模型组略有好转。

各组大鼠左侧肾肾脏器系数(肾湿重/体质量×100%)比较：根据实验结果，与假手术组，同时期模型组左肾脏器指数显著降低(P<0.05)，说明左肾衰竭模型成功制备。与模型组相比，肾衰方及其拆方组和贝那普利组脏器指数升高(P<0.05)，其中第14天肾衰方组大鼠术侧肾肾脏器系数明显高于其他三个治疗组，差异具有统计学意义(P<0.05)，结果见表1。

大鼠肾脏病理改变：HE染色见假手术组大鼠肾小球、肾小管结构清晰，肾小管排列紧密，肾小管周围间质无增宽；模型组大鼠术后第7天起观察到肾小管管腔扩张，肾小管周围间质增宽、水肿并伴有大量炎性细胞浸润，随梗阻时间延长更加严重。但梗阻早期(术后第7天)肾小球结构相对完整，各治疗组大鼠较同期模型组上述病变有所改善。模型组及各治疗组较假手术组显著降低(P<0.05)，模型组与治疗组比较亦有显著差异(P<0.05)，且第14天肾衰方组大鼠肾小管损伤程度评分低于其他三个治疗组，差异有统计学意义(P<0.05),见表2。Masson染色见假手术组大鼠肾小球基底膜、系膜区及肾小管间质无明显胶原沉积；模型组大鼠肾脏见增宽的间质充满着大量蓝紫色条索状胶原，随梗阻时间延长加重。各治疗组大鼠较同期模型组胶原沉积明显减少。模型组及各治疗组较假手术组显著降低(P<0.05)，模型组与治疗组比较亦有显著差异(P<0.05)，且第14天肾衰方组肾小管间质纤维化指数明显低于其他三个治疗组，差异有统计学意义(P<0.05),见表2。

表1 各组大鼠术侧肾肾脏器系数变化比较

注：与同时期假手术组比较，*P<0.05；与同时期模型组比较,#P<0.05；与同时期其他三个治疗组比较,※P<0.05

2.2 各组大鼠术侧肾脏组织MMP7、α-SMA蛋白表达比较

如表3，MMP7蛋白在假手术组大鼠肾小管间质仅见于少量的阳性表达，造模后，肾小球系膜和基底膜也出现弱阳性表达。随着手术时间的延长，MMP7表达减少，肾间质纤维化病理程度逐渐加重。经治疗后，各治疗组MMP7蛋白表达均有所增加，以肾衰方组更明显，差异有统计学意义(P均<0.05)。术后第14天，肾衰方组>祛邪方>补虚方阻>贝那普利组增，差异有统计学意义(P<0.05)。假手术组大鼠肾皮质α-SMA蛋白表达较少；与假手术组相比，模型组大鼠术后第7天α-SMA蛋白表达显著增多(P<0.05)，随着梗组时间的延长，α-SMA蛋白表达的增多更明显(P均<0.05)。治疗后各治疗组α-SMA蛋白的表达有所下降，以术后第14天更明显(P均<0.05),尤以肾衰方组更佳(P均<0.05)。

表2 各组大鼠肾小管损伤程度评分及肾小管间质纤维化指数

注：与同时期假手术组比较，*P<0.05；与同时期模型组比较,#P<0.05；与同时期其他三个治疗组比较，※P<0.05

表3 各组大鼠肾组织MMP-7、α-SMA蛋白表达

注：与同时期假手术组比较，*P<0.05；与同时期模型组比较,#P<0.05；与同时期其他三个治疗组比较，※P<0.05

3 讨论

我们团队经过多年的临床及实验，认为肾纤维化的病机归纳为“虚”“湿”“瘀”“毒”四个方面，“虚”是始因，湿、瘀是肾纤维化微型癥积形成的病理基础，而毒促进肾纤维化的进展。本病为本虚标实之证，本虚以脾肾亏虚为主；标实以湿浊、痰瘀、浊毒为主。在早期，标实为主，以祛湿泄浊，活血化瘀为法，到了晚期，正气耗伤，当以扶正为主，补益脾肾，泄浊解毒。病机关键是“脾肾亏虚、湿浊内蕴，瘀毒闭阻”，故治疗以益肾健脾、化瘀利湿、解毒泄浊为法。肾衰方正是依据此病机研制而成，由生黄芪、生地黄、党参、山萸肉、淮山药、丹参、泽泻、土茯苓、白花蛇舌草、六月雪、生大黄、淫羊藿组成。方中用丹参易丹皮增强活血化瘀之功效，以党参代人参补中益气，合黄芪健运脾阳，布施精微，生地黄益阴血、山萸肉补肝肾、山药健脾固肾滋精、泽泻利水渗湿、茯苓健脾利水，诸药合用既可益气固肾涩精，以护其本；又可健脾补肾填精，以培其源，配以苦寒生大黄，泄浊毒、破积滞、行瘀血，使浊毒从肠胃而出、白花蛇舌草清热解毒、六月雪健脾利湿，活血及温而不燥的淫羊藿温肾阳而补肾气，全方组方严格，紧扣病机，益肾而不留邪，降浊而不伤正，补中有泻，寓泻于补，以标本同治之，具有益肾、解毒、化瘀的功效。 补虚方组(生黄芪、党参、生地黄、山萸肉、山药和淫羊藿共7味中药)、袪邪方组(生大黄、丹参、白花蛇舌草、六月雪、土茯苓、泽泻共6味中药)，通过拆方进行治疗，进一步佐证肾间质纤维化是否为本虚标实之证。

肌成纤维细胞与肾小管间质纤维化的发生关系最为密切，而肾间质固有成纤维细胞和肾小管上皮细胞向肌成纤维细胞的表型转化是肌成纤维细胞的主要来源之一，肾间质纤维化(RIF)以成纤维细胞的增生及胶原、各种连接蛋白等细胞外基质的沉积为主要表现。α-SMA是平滑肌细胞的标志蛋白，是间质成纤维细胞转化为α-SMA的肌成纤维细胞关键步骤[4]，这是肾间质纤维化的发生的关键，也是导致肾间质纤维化的重要机制。本实验结果显示，模型组大鼠肾间质可见ECM大量沉积，α-SMA蛋白表达激活，肾脏器系数显著降低，肾组织严重病理损害，出现肾间质纤维化。经治疗后，α-SMA蛋白表达显著减少，肾间质沉积的ECM明显降低， 肾脏器系数显著升高，肾组织病理检查也有所改善，尤以肾衰方组治疗效果最佳，肾衰方>祛邪方>补虚方>贝那普利。

MMPs直接以酶原的形式分泌到EMC中，并在正常生理条件下起到降解细胞外基质的功效。MMPs 的这一作用运用在预防或治疗疾病，现已在各个系统疾病中被广泛研究[5]。而MMP-7 是MMP家族中分子量最小的一类，有着强大的降解作用，包括构成基底膜的基质成分在内的细胞外基质。大量的研究证实，MMP-7 通过降解细胞外基质成分[6]。在肾纤维化小鼠模型中发现，通过抑制内皮细胞分泌MPP7进而抑制ECM降解，促进肾小鼠组织纤维化进程[7]。通过促进MPP7表达，从而对肾间质纤维化起到预防及逆转作用。本实验结果发现，模型组大鼠肾间质MPP7表达明显降低，胶原沉积则显著增多，经肾衰方治疗后，可明显上调MPP7表达量，从而减少胶原的过度沉积，肾间质纤维化程度降低。尤以肾衰方组效果更佳。肾衰方>祛邪方>补虚方>贝那普利。说明肾间质纤维化时，随着药物诱导蛋白表达的MPP7增加，也进一步证实了肾间质纤维化属于本虚标识之证，治疗需标本兼顾。

中药肾衰方抗肾间质纤维化作用机制可能作用机制是通过诱导肾间质MPP7蛋白的表达，抑制α-SMA蛋白的表达，从而抑制ECM的积聚，延缓纤维化进展，且肾间质纤维化为本虚标实之证。